Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

• Hướng dẫn cho nhân viên phòng thí nghiệm thực hiện quy trình xác định đột biến gen αGlobin bằng bộ sinh phẩm α-Globin StripAssay® Vienna Lab (4-160).  
• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện. 

2. Nguyên lý  

• α-Globin stripassay là một phương pháp phát hiện đột biến bằng cách kết hợp 3 kỹ thuật là phản ứng chuỗi trùng ngưng DNA, phản ứng lai bổ sung, và phản ứng quang hóa. Một cách ngắn gọn, quy trình gồm ba bước chính: (1) nhân đoạn DNA mong muốn bằng mồi có gắn biotin, (2) lai DNA có gắn biotin với những đoạn oligonucleotide đặc hiệu được gắn trên thanh lai, (3) phát hiện những đoạn DNA có gắn biotin trên thanh lại bằng phản quang hóa. α-Globin stripassay phát hiện 21 đột biến thường gặp trên gen α-Globin của người Đông Nam Á. 

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan  

• Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó.  
• Phản ứng lai theo nguyên tắc bổ sung là một kỹ thuật sử dụng nguyên tắc bắt cặp bổ sung, nghĩa là A với T, và C với G. Phản ứng này cho phép hai sợi axit nucleic đơn có thể bắt cặp với nhau nếu trình tự bổ sung của chúng đủ tương đồng với nhau. Kỹ thuật này cho phép phát hiện những trình tự đặc hiệu hoặc có thể sử dụng để đánh giá mức độ tương đồng của trình tự.  
• Phản ứng quang hóa là một phương pháp phát hiện dựa trên sự phát quang của một phản ứng hóa học được xúc tác bởi enzyme.

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất 

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất 

5. An toàn  

Các yêu cầu về an toàn phòng xét nghiệm được đề cập tại mục 5 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu (1 cặp mồi)

6. Quy trình Phát đột biến gen Alpha Globin

6.1. Loại mẫu  

• 2 ml máu ngoại vị chống đông EDTA, bảo quản 2-8°C 

6.2. Tiếp nhận mẫu  

• Thực hiện các bước như đã đề cập trong mục “6.2. Tiếp nhận mẫu” của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau”

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình  

• Ghi Biểu mẫu theo dõi thực hiện xét nghiệm, lưu bản mềm trên máy tính, ổ chung của Khối.

6.4. Các bước tiến hành 

6.4.1. Bước tách DNA và tiêu chuẩn đạt của mẫu sau tách chiết được đề cập cụ thể tại mục 6.3 của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau”Khuếch đại DNA  

• Giữ hóa chất của phản ứng chuỗi trùng ngưng DNA và mẫu DNA trên đá lạnh trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm  
• Pha loãng 1 ul Taq DNA Polymerase (red cap) trong 24 µl dung dịch pha loãng Taq (transparent cap) (1:25, final conc. 0.2 U/µl).  
• Pha loãng mẫu DNA để có nồng độ từ 2-20 ng/ µl.  
• Với mỗi phản ứng PCR: trộn 15 µl Amplification Mix (yellow cap), 5 µl Taq DNA polymerase (đã pha loãng – nồng độ phản ứng 1U) và 5 µl mẫu DNA (nồng độ phản ứng: 10 – 100 ng) trong một ống PCR .
• Đóng chặt nắp ống, voltex 15 giây, và ly tâm 30 giây.  
• Đặt ống phản ứng PCR vào máy PCR proflex và chạy chương trình nhiệt như sau: 
  • 95𝇈C/5 phút 
  • [97𝇈C/40 giây – 64𝇈C/40 giây – 72𝇈C/1 phút 30 giây] x 3 chu kì 
  • [97𝇈C/40 giây – 58𝇈C/40 giây – 72𝇈C/1 phút 30 giây] x 37 chu kì 
  • 72𝇈C/5 phút 
  • 4𝇈C/∞

• Giữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ từ 2-8°C. 

6.4.2.Kiểm tra sản phẩm PCR (Không bắt buộc):  

• Sử dụng gel agarose 1,5% trong đệm TBE 0,5X.  
• Mỗi phản ứng dùng 5 μl trộn với 0.5 μl 10x loading dye để điện di cùng 3.5 μl thang chuẩn 1kb (đã pha cùng loading dye).  
• Điều kiện điện di: 100 V, 30 phút.  
• Chụp ảnh ghi kết quả.  
• Kết quả điện di hợp lệ: đối chứng âm không xuất hiện băng. 

6.4.3. Phản ứng lai và nhận định kết quả  

• Chuẩn bị bể ổn nhiệt với mức nước bằng ½ chiều cao bể, nhiệt độ 45oC. Làm ấm Hybridization Buffer và Wash Solution A trong bể ổn nhiệt 45oC để tan hết kết tủa khi dung dịch bị để lạnh.  
• Đặt nhiệt độ máy lắc ủ nhiệt về 45oC. Để Teststrips, DNAT, Conjugate Solution, Wash Solution B và Color Developer về nhiệt độ phòng.  
• Chuẩn bị khay lai, đánh dấu các rãnh với số mẫu tương ứng. Dùng panh kẹp lấy Teststrip và đánh dấu mẫu tương ứng bằng bút chì (bên ngoài marker line). Việc kí hiệu trên thanh lai để nhận dạng mẫu cần được ghi bằng bút chì, và ghi 3 chữ số cuối cùng của LID.  
• DNAT chứa 1.6% NaOH. Cẩn thận: kích ứng da, kích ứng mắt. Cần trang bị dụng cụ bảo hộ (găng tay, áo, kính, khẩu trang). Nếu có kích ứng mắt cần được chăm sóc y tế.  
• Tra 20 μL DNAT (nắp xanh dương) vào rãnh sẽ sử dụng trên khay lai (rãnh tương ứng với mẫu A1 và A2).  
• Tra 10 μL DNAT (nắp xanh dương) vào rãnh sẽ sử dụng trên khay lai (rãnh tương ứng với một mẫu B). 
• Tra 10 μL sản phẩm PCR vào vị trí của mẫu tương ứng. Bước này cần có người thứ 2 double check để chắc chắn, sản phẩm PCR được nhỏ đúng vào khay có tên tương ứng.  
• Trộn đều bằng pipetman (dung dịch vẫn còn màu xanh).  
• Ủ hỗn hợp trên 5 phút ở nhiệt độ phòng.  
• Thêm 1 mL Hybridization Buffer (đã được làm ấm đến 45oC) vào mỗi rãnh, lắc khay nhẹ nhàng cho đến khi màu xanh biến mất.  
• Đặt testStrip đã đánh dấu vào trong rãnh có sản phẩm PCR tương ứng sao cho mặt có marker (chiều mặt nhám) ở bên trên, toàn bộ testStrip ngập trong dung dịch. Bước này cần có người thứ 2 double check thông tin ký hiệu trên thanh lai được đặt đúng vào khay có tên tương ứng. 
• Ủ hỗn hợp 30 phút ở 45oC trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút (lắc liên tục).  
• Loại bỏ dung dịch lai bằng pipet pasteur.  
• Thêm 1 mL Wash Solution A (45oC), tráng nhẹ 10 lần.  
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution A bằng pipet pasteur, thêm 1 mL Wash Solution A (45oC) mới, ủ 15 phút ở 45oC trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút. 
• Lặp lại bước trên.  Làm nguội máy lắc ủ nhiệt về nhiệt độ phòng.  
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution A bằng pipet pasteur, thêm 1 mL Conjugate Solution vào khay, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.  
• Loại bỏ dung dịch Conjugate Solution, thêm 1 mL Wash Solution B, tráng nhẹ khoảng 10 lần.  
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution B bằng pipet pasteur, thêm 1 mL Wash Solution B mới, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.  
• Lặp lại bước trên.  
• Tắt đèn.  
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution B bằng pipet pasteur, thêm 1 mL Color Developer, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng trong máy lắc ủ nhiệt (tránh tiếp xúc với ánh sáng), tốc độ 250 vòng/phút. Các vết màu tím sẽ xuất hiện nếu có phản ứng dương tính.  
• Rửa 5 lần với nước cất.  
• Để teststrip khô (tránh tiếp xúc với ánh sáng) rồi đọc kết quả (không để teststrip tiếp xúc với ánh sáng mạnh sau phản ứng phát hiện màu).

6.4.4.Nhận định kết quả  

• Dán Teststrip lên Collector Sheet, dóng 2 vạch đỏ và xanh tương ứng với mô tả. Vạch 1-22 là vạch biểu thị kiểu gen đột biến. Vạch 23 -35 là vạch biểu thị kiểu gen bình thường.  
• Lưu ý: Cường độ màu của các vạch dương tính có thể khác nhau  
• Thiết kế của một thanh lai.
• Kết quả dương tính (xuất hiện băng) ở vạch “Control” cho thấy hoạt tính tốt của Conjugate Solution và Color Developer.  
• Đối với mỗi biến dị thì một trong 3 mẫu nhuộm sau đây sẽ được biểu hiện

Ghi chú: Genotypes = kiểu gen; Nor = bình thường; HET = dị hợp tử; HOM = đồng hợp tử; Mutant = đột biến; wild type = bình thường; Positive = dương tính; Negative = âm tính

7. Kiểm soát chất lượng  

• Mẫu DNA có nồng độ >/= 10 ng/ul; 260/280 = 1.8-2.0; 260/230 >/=2.  
• Kết quả điện di: chỉ có ba băng tương đương kích thước 310, 381 và 755 bp.  
• Có băng ở vạch “control”.  
• Có ít nhất một băng tương đương vạch 1-35 được phát hiện 

8. Xử lý mẫu và chất thải 

• Đã được đề cập ở mục 8 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu – 1 cặp mồi” 

9. Phụ lục/bảng kiểm/biểu mẫu  

• Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi xét nghiệm: BM01: XP-006  

• Phụ lục 2: Phiếu trả kết quả xét nghiệm: BM02: XP-006  

• Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện quy trình phát hiện đột biến gen Alpha-globin bằng kỹ thuật StripAssay SEA ® Vienna Lab (4-160)

• Phụ lục 4: Bảng kiểm thực hiện quy trình 

Tài liệu tham khảo/Tài liệu liên quan

• https://www.viennalab.com/products/genetic_disorders/thalassemia_alphaglobin_betaglobin_stripas say?showAll=1 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0