Đặc điểm phân tử của ung thư bàng quang

Tóm tắt nội dung
Ung thư biểu mô bàng quang là một bệnh lý ác tính phổ biến cướp đi sự sống của khoảng 150.000 người mỗi năm trên toàn thế giới. Cho đến nay, chưa có phương pháp điều trị đích nào nhằm vào hoạt động của các phân tử. Nằm trong dự án Bản đồ bộ gen ung thư, chúng tôi đã đưa vào đây một phân tích tổng hợp của 131 mẫu ung thư biểu mô nhằm cung cấp một cảnh nhìn toàn diện về sự thay đổi phân tử. Có những đột biến lặp lại có ý nghĩa thống kê ở 32 gen, bao gồm nhiều gen liên quan đến quy định chu kỳ tế bào, điều hòa nhiễm sắc thể và con đường tín hiệu kinase, cũng như 9 gen trước đây chưa được báo cáo là đột biến đáng kể trong bất kỳ bệnh ung thư nào. Việc giải trình tự RNA cho thấy xuất hiện bốn kiểu gen phụ, hai kiểu trong số đó (dạng nhú và dạng nền / dạng vảy) cũng thể hiện rõ trong dữ liệu protein và trình tự microRNA. Giải trình tự toàn bộ bộ gen và RNA đã xác định được trình tự tái phát trong khung kích hoạt FGFR3 – hợp nhất TACC3 và biểu thức hoặc tích hợp nhiều loại virus (bao gồm cả HPV16) có liên quan đến việc bất hoạt gen. Các phân tích của chúng tôi đã xác định mục tiêu điều trị tiềm năng ở 69% khối u, trong đó 42% với mục tiêu đối với phosphatidylinositol-3-OH kinase / AKT / mTOR và 45% với mục tiêu (bao gồm ERBB2) trong con đường RTK / MAPK. Các gen điều hòa nhiễm sắc thể thường xuyên bị đột biến trong ung thư biểu mô biểu mô hơn so với bất kỳ bệnh ung thư phổ biến nào khác được nghiên cứu cho đến nay, cho thấy khả năng trong tương lai của liệu pháp đích đối với các bất thường nhiễm sắc thể.

Nội dung chính

Ung thư bàng quang là nguyên nhân chính gây ra bệnh tật và tử vong trên toàn thế giới, ước tính khoảng 150.000 ca tử vong mỗi năm. Các nghiên cứu trước đây đã xác định sự thay đổi số lượng bản sao tế bào xô ma ở nhiều vị trí, bao gồm khuếch đại PPARG, E2F3, EGFR, CCND1 và MDM2, cũng như mất CDKN2A và RB1 (tham chiếu 2, 3). Việc xác định trình tự hình thành các gen đã cho thấy các đột biến tái phát ở TP53, FGFR3, PIK3CA, TSC1, RB1 và HRAS (tham chiếu 2, 3). Giải trình tự toàn bộ exome của 9 bệnh ung thư bàng quang, sau đó là phân tích sao chép của 88 bệnh ung thư, xác định các đột biến ở tần số trên 10% trong một số gen tái tạo nhiễm sắc: KDM6A, CREBBP, EP300 và ARID1A (tham khảo 4). Các phân tích phân tử tập trung 5,6 đã xác định các phân nhóm khối u và xác định FGFR3 hợp nhất gen kinase hoạt hóa ^{7 , 8} .

Chúng tôi đưa ra đây một nghiên cứu tổng hợp, toàn diện về 131 loại ung thư biểu mô bàng quang xâm lấn cơ cấp độ cao – một phần của dự án Bản đồ bộ gen ung thư (TCGA). Bao gồm dữ liệu về số lượng bản sao DNA, đột biến tế bào xô ma, RNA thông tin và microRNA (miRNA), biểu hiện protein và phosphoryl hóa protein, methyl hóa DNA, biến thể mối nối phiên mã, dung hợp gen, tích hợp virus, xáo trộn quá trình hình thành, tương quan lâm sàng và mô bệnh học để mô tả đặc trưng phân tử của ung thư biểu mô niệu quản. Nghiên cứu này xác định một số đột biến và vùng thay đổi số lượng bản sao liên quan đến các gen chưa được công bố trước đây đã bị thay đổi đáng kể ở các trường hợp ung thư bàng quang. Nghiên cứu cũng xác định các mục tiêu điều trị tiềm năng ở hầu hết các mẫu được phân tích.

Dữ liệu nhân khẩu học, lâm sàng và bệnh lý

Các mẫu (từ 19 vị trí mô) bao gồm 131 khối u biểu mô cấp độ cao chưa được hóa trị, xâm lấn cơ, (T2-T4a, Nx, Mx), cũng như bệnh mạch máu ngoại vi (n = 118) và / hoặc khối u lân cận, mô bàng quang bình thường về mặt mô học (n = 23). Chỉ các trường hợp đáp ứng các tiêu chuẩn sau sẽ được giữ lại: Nhân khối u chiếm ≥60% tổng số nhân; hoại tử khối u là ≤20% mẫu vật; và mô học biến thể (tế bào vảy hoặc tế bào nhỏ) là ≤50% (Thông tin bổ sung, phần ‘Thu thập mẫu sinh học và dữ liệu lâm sàng’). Các đặc điểm lâm sàng và nhân khẩu học được mô tả trong Dữ liệu Bổ sung 1.1. Năm chuyên gia về bệnh học tiết niệu có chuyên môn đã xem xét lại tất cả các trường hợp để tìm nhiều thông số, bao gồm mức độ mô học của biến thể (Hình 1.1a và Thông tin bổ sung, phần ‘Thu thập mẫu sinh học và dữ liệu lâm sàng’).

Đột biến xôma

Các khối u cho thấy một số lượng lớn các thay đổi DNA, ít hơn một chút so với ung thư phổi và khối u ác tính, nhưng nhiều hơn so với các khối u ác tính khác ở người trưởng thành được nghiên cứu bởi TCGA (Dự án Bản đồ bộ gen ung thư) (Hình 1) ⁹. Trung bình, có 302 đột biến exonic, 204 thay đổi đoạn về số bản sao bộ gen và 22 lần sắp xếp lại bộ gen trên mỗi mẫu

Chúng tôi đã phân tích sự thay đổi số lượng bản sao xôma (CNA) bằng cách sử dụng cả mảng SNP 6.0 và giải trình tự toàn bộ bộ gen thế hệ mới; hai phương pháp này hoàn toàn phù hợp (Phương pháp bổ sung 6.1 và Hình bổ sung 6.1). Có 22 thay đổi đáng kể về số lượng bản sao cấp độ nhánh (Dữ liệu bổ sung 6.1.1) và GISTIC (xác định bộ gen của các mục tiêu quan trọng trong ung thư) (Phương pháp bổ sung 6.2) đã xác định 27 CNA xôma khu trú khuếch đại và 30 xôma đầu mối tái phát bị xóa (Dữ liệu bổ sung 6.2.1 và 6.3.1). Khuếch đại tập trung liên quan đến các gen trước đây được báo cáo là bị thay đổi trong ung thư bàng quang (Hình 1c và Hình bổ sung. 6.2.1) và một số gen không liên quan trước đây. Sau đó bao gồm PVRL4, BCL2L1 và ZNF703. Hiện tượng xóa tiêu cự lặp lại phổ biến nhất, được thấy trong 47% mẫu, chứa CDKN2A (9p21.3) và tương quan với giảm biểu hiện (Hình 1 và Hình bổ sung 2.7). Sự xóa tiêu điểm khác có chứa <10 gen dường như nhắm mục tiêu đến PDE4D, RB1, FHIT, CREBBP, IKZF2, FOXQ1, FAM190A (còn gọi là CCSER1), LRP1B và WWOX.

[Hình 1: Mô tả gen của ung thư bàng quang]

a, Tỷ lệ và kiểu đột biến, kiểu phụ mô học, tình trạng hút thuốc, giới tính, giai đoạn khối u và kiểu cụm. b, Các gen có mức độ đột biến có ý nghĩa thống kê (MutSig, tỷ lệ phát hiện sai dưới 0,1) và dạng đột biến. c, Xóa và khuếch đại đối với các vùng gen có sự thay đổi số lượng bản sao tiêu điểm có ý nghĩa thống kê (GISTIC2.0). ‘Số bản sao’ thể hiện số bản sao tuyệt đối. Lưu ý rằng hai đỉnh khuếch đại (*) chứa một số gen, bất kỳ gen nào trong số đó có thể là đích, trái ngược với gen đơn được liệt kê ở đây. d, Mức độ biểu hiện của RNA đối với các gen đã được chọn, được biểu thị bằng sự thay đổi số lần so với giá trị trung bình của tất cả các mẫu. Các mẫu khối u được nhóm thành ba cụm (đỏ, xanh dương và xanh lục) bằng cách sử dụng phân nhóm NMF đồng thuận (xem văn bản chính và Hình bổ sung. 2.1.2). Ba mẫu không có dữ liệu số bản sao và hai mẫu không có đột biến gen đã không được sử dụng trong phân nhóm và được hiển thị bằng màu xám.

Giải trình tự toàn bộ exome của 130 khối u và đối sánh với các mẫu bình thường nhắm mục tiêu 186.260 exon trong 18.091 gen (mức độ bao phủ trung bình gấp 100 lần, với 82% cơ sở đích được bao phủ> 30 ×). MuTect10 đã xác định được 39.312 đột biến xôma (bao gồm 38.012 đột biến điểm và 1.138 indels (chèn hoặc xóa)), mang lại tỷ lệ đột biến xôma trung bình và lần lượt là 7,7 và 5,5 trên mỗi megabase (Mb) (Hình 1a và Bảng bổ sung 2.1.1). 32 gen cho thấy mức độ đột biến xôma tái phát có ý nghĩa thống kê (Hình 1b và Bảng bổ sung 2.1.2) bằng cách phân tích sử dụng MutSig 1.5 (tham chiếu 9, 11) (Phương pháp bổ sung 2.2). 3 gen khác được xác định bởi MutSig không được xem xét thêm vì biểu hiện thấp hoặc không thể phát hiện được (Hình bổ sung 2.1.1). Một phân tích tương tự chỉ xem xét các đột biến trong cơ sở dữ liệu COSMIC2 đã xác định được 3 gen đột biến đáng kể hơn là: ERBB2, ATM và CTNNB1 (Bảng bổ sung 2.1.3). Chúng tôi xác nhận các phát hiện đột biến theo ba cách: giải trình tự lại có mục tiêu của tất cả các đột biến gen bị đột biến đáng kể, so sánh với dữ liệu RNA-seq cho 123 mẫu và so sánh với dữ liệu trình tự toàn bộ bộ gen cho 18 mẫu. Nhìn chung, tỷ lệ xác nhận là trên 99% trong các đột biến được chọn bằng cách kết hợp các phương pháp (Phương pháp bổ sung 2.4).

Gần một nửa (49%) mẫu có đột biến TP53 (Hình 1b), triệt tiêu trong mối quan hệ của chúng với sự khuếch đại (9%) và biểu hiện quá mức (29%) của gen MDM2; do đó, chức năng của gen TP53 đã bị vô hiệu hóa trong 76% mẫu. Hầu hết các đột biến RB1 đều vô hiệu hóa, có liên quan đến mức mRNA giảm đáng kể (Hình bổ sung 2.7) và loại trừ lẫn nhau với sự mất đoạn CDKN2A (Hình bổ sung 2.8 và Bảng bổ sung 2.8.1). Đột biến FGFR3 (12%) thường ảnh hưởng đến các vị trí kích hoạt kinase như đã biết. Các đột biến PIK3CA tương đối phổ biến (20%), tập hợp lại trong vùng xoắn gần E545 (Hình bổ sung 2.4). Hầu hết các đột biến TSC1 (8%) cắt ngắn và sáu đột biến là đồng hợp tử (tỷ lệ alen trên 0,5).

Nhiều trong số 32 gen được xác định trong Hình 1b trước đây không được báo cáo là đột biến có ý nghĩa thống kê trong ung thư bàng quang như: MLL2 (còn gọi là KMT2D; 27%), CDKN1A * (14%), ERCC2 * (12%), STAG2 (11 %), RXRA * (9%), ELF3 * (8%), NFE2L2 (8%), KLF5 * (8%), TXNIP (7%), FOXQ1 * (5%), RHOB * (5%), FOXA1 (5%), PAIP1 * (5%), BTG2 * (5%), ZFP36L1 (5%), RHOA (4%) và CCND3 (4%). Chín gen được đánh dấu hoa thị không được báo cáo là gen đột biến đáng kể trong bất kỳ loại ung thư nào theo Bản đồ bộ gen ung thư  –  TCGA nào khác hoặc được báo cáo trong một nghiên cứu khác là đột biến ở tần số trên 3 %2. CDKN1A (p21CIP1), một chất ức chế kinase12 phụ thuộc cyclin, có các đột biến chủ yếu là vô hiệu hoặc cắt ngắn, cho thấy mất chức năng. 15 trong số 16 đột biến ở ERCC2, một gen sửa chữa loại bỏ nucleotide13, là những đột biến nguy hại nghiêm trọng, cho thấy những tác động tiêu cực. Các khối u đột biến ERCC2 cũng có ít đột biến C> G hơn đáng kể so với khối u ác tính kiểu hoang dã ERCC2 (Hình 2.3.1 và 2.3.2), và chúng có xu hướng hướng tới tỷ lệ đột biến tổng thể cao hơn (Hình 2.12). 7 trong số 12 đột biến trong RXRA (thụ thể nhân retinoid X alpha) 14 xảy ra ở cùng một axit amin (năm S427F; hai S427Y) trong miền liên kết phối tử. 7 khối u đó cho thấy sự biểu hiện gia tăng của các gen liên quan đến quá trình tạo mỡ và chuyển hóa lipid (Hình bổ sung 2.6 và Dữ liệu bổ sung 2.6.1–2.6.3), cho thấy rằng các đột biến gây ra sự hoạt hóa cấu thành.

Mười một khối u (8%) có đột biến gây hại nghiêm trọng trong vùng Neh2 của NFE2L2, một yếu tố phiên mã điều chỉnh chống oxy hóa để cân bằng oxy hóa 15. Những khối u đó cho thấy sự biểu hiện gia tăng rõ rệt của các gen liên quan đến chuyển hóa độc tính gen và phản ứng của các loài oxy phản ứng (ROS) (Hình 2.5.1–2.5.3 và Dữ liệu bổ sung 2.5.2). Hơn nữa, 9 mẫu có đột biến trong cơ chế điều hòa oxy hóa khử TXNIP (tham chiếu 16) (năm trong số chúng vô hiệu hóa) và loại trừ lẫn nhau các mẫu có đột biến NFE2L2, cung cấp một cơ chế khác để điều hòa chuyển hóa oxy hóa khử. Các đột biến làm vô hiệu hóa cơ bản được tìm thấy ở STAG2, một thành phần phức hợp gắn liên kết X cần thiết để tách các chromatid chị em trong quá trình phân chia tế bào 17 (Hình bổ sung 2.4).

Phân nhóm không giám sát bằng cách phân tích nhân tử ma trận không âm của các đột biến và CNA xôma tiêu điểm trong 125 mẫu xác định 3 nhóm riêng biệt (Hình 1a và Hình bổ sung 2.1.2). Nhóm A (màu đỏ), được phân loại là “khuếch đại toàn bộ”, rất giàu CNA xôma tiêu điểm trong một số gen, cũng như các đột biến trong MLL2 (Hình 1 và Bảng bổ sung 2.1.4 và 2.1.5). Nhóm B (màu xanh lam), được phân loại là ‘đột biến nhú CDKN2A thiếu FGFR3’, được hình thành trong dạng nhú. Gần như tất cả các mẫu nhóm B đều cho thấy mất CDKN2A và hầu hết có một hoặc nhiều thay đổi trong FGFR3. Nhóm C (màu xanh lá cây), được phân loại là ‘TP53 / tế bào-chu kỳ-đột biến’, cho thấy các đột biến TP53 trong gần như tất cả các mẫu, cũng như phát triển với đột biến RB1 và sự khuếch đại của E2F3 và CCNE1 (Hình 1 và Bảng bổ sung 2.1.4) . Những khác biệt về kiểu đột biến này cho thấy khả năng xảy ra các cơ chế gây ung thư khác nhau.

72% trường hợp ung thư trong nghiên cứu này là từ những người hút thuốc hoặc tiền sử hút thuốc lá, phù hợp với các nghiên cứu dịch tễ học mở rộng chỉ ra mối liên quan giữa hút thuốc và nguy cơ ung thư biểu mô. Tuy nhiên, ngược lại với ung thư phổi, không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa tình trạng hút thuốc và phổ đột biến gen, tần suất đột biến ở bất kỳ gen đột biến đáng kể nào, sự xuất hiện của CNA xôma khu trú hoặc kiểu phụ biểu hiện (Bảng bổ sung 2.9.1 và 2.9.2) . Những người không bao giờ hút thuốc có tỷ lệ đột biến C> G cao hơn một chút so với những người hút thuốc hiện tại / trước đây (28,5% so với 23,8%, P = 0,032; Hình bổ sung 2.3.2 và 2.3.3). Dữ liệu về sự methyl hóa DNA đảo CpG không được giám sát cho thấy một phân nhóm chính (34%) khối u (CIMP) được đặc trưng bởi hiện tượng siêu methyl hóa DNA đặc hiệu cho bệnh ung thư (Hình bổ sung 7.1). Phân tích hồi cứu đa biến với tuổi, giới tính và giai đoạn khối u dưới dạng đồng biến xác định số năm hút thuốc là yếu tố dự báo quan trọng duy nhất về kiểu hình CIMP, cũng như đã được đưa ra đối với ung thư đại trực tràng 18.

51% các đột biến nói chung là Tp * C -> (T / G) (Bảng bổ sung 2.1.1), một loại đột biến gần đây được đưa ra là do một trong các gen hủy DNA cytosine, APOBEC trung gian (tham chiếu 19, 20 ). APOBEC3B được biểu hiện ở mức độ cao trong tất cả các khối u, cho thấy vai trò chính đối với sự đột biến qua trung gian APOBEC trong quá trình sinh ra ung thư bàng quang (Hình bổ sung 12.1 và 12.2).

4 kiểu gen liên quan đến biểu sinh là gen đột biến đáng kể: MLL2, ARID1A, KDM6A và EP300 (Hình 1). Các đột biến cắt đoạn được hình thành   trong mỗi gen đó (Hình bổ sung 2.2 và Dữ liệu bổ sung 2.2.1–2). 3 trong số các gen trước đây đã được xác định là đột biến trong ung thư biểu mô 4, nhưng đột biến MLL2, mã hóa histone H3 lysine 4 (H3K4) methyltransferase, là một phát hiện mới. Một số gen điều hòa chất nhiễm sắc khác có tỷ lệ đột biến ≥10% nhưng không có ý nghĩa thống kê bằng phân tích MutSig: MLL3, MLL, CREBBP, CHD7 và SRCAP. Nhiều cơ quan điều hòa biểu sinh khác bị đột biến ở tần số thấp hơn nhưng cũng được làm giàu với các đột biến cắt bớt, cho thấy ý nghĩa về mặt chức năng (Hình 2.2 và Dữ liệu bổ sung 2.2.1 và 2.2.2). Các đột biến không âm thầm trong các gen điều hòa nhiễm sắc nói chung đã hình thành ung thư bàng quang đáng kể so với toàn bộ exome, trái ngược với tất cả các bệnh ung thư biểu mô khác được nghiên cứu cho đến nay trong dự án TCGA (Bảng bổ sung 2.10). Các đột biến trong MLL2 và KDM6A (mã sau này mã hóa cho histone H3 lysine 27 (H3K27) demethylase) loại trừ lẫn nhau (Hình bổ sung 2.8 và Bảng bổ sung 2.8.1), cho thấy rằng các đột biến trong 2 gen có tác động dư thừa đối với chất sinh ung thư hoặc nguy hại lớn là gây tử vong ở người.

Sự sắp xếp lại nhiễm sắc thể và tích hợp virus

Để xác định các biến thể cấu trúc và quá trình gây bệnh, chúng tôi đã sử dụng giải trình tự toàn bộ bộ gen thông qua thấp, kết đôi, (WGS; 6–8 × bao phủ) của 114 khối u và giải trình tự RNA của tất cả các khối u. Chúng tôi đã phát hiện ra 2.529 sai lệch cấu trúc, bao gồm 1.153 cấu trúc liên quan đến dung hợp gen – gen. Trong số các trường hợp chuyển đoạn, có 379 trường hợp là chuyển đoạn giữa các nhiễm sắc thể xen kẽ nhau, 237 trường hợp chuyển đoạn là giữa các nhiễm sắc thể nội, 274 là kết quả của sự đảo đoạn và 263 là kết quả của sự mất đoạn (Bảng bổ sung 3.1). Chúng tôi nhận thấy một số chuyển đoạn lặp lại biểu hiện việc hình thành bệnh lý, bao gồm chuyển đoạn trong nhiễm sắc thể trên nhiễm sắc thể 4 liên quan đến FGFR3 và TACC3 (n = 3). Các đột biến nằm trong vùng intron 16 (hai trường hợp) hoặc exon 17 (một trường hợp) của FGFR3 và intron 10 của TACC3 (được xác nhận bằng giải trình tự DNA và RNA-seq). Cả ba đều dẫn đến các sản phẩm mRNA dung hợp mà các protein được dự đoán bao gồm 758 axit amin đầu tận cùng của FGFR3 được hợp nhất với 191 axit amin đầu tận cùng cacboxy của TACC3 (Hình 2a). Trên cơ sở cấu trúc của protein dung hợp FGFR3 – TACC3, chúng tôi dự đoán rằng nó có thể tự động hóa, dẫn đến kích hoạt cấu tạo miền kinase của FGFR3. Sự hợp nhất FGFR3 – TACC3, gần đây đã được mô tả trong cả u nguyên bào thần kinh đệm 21 và ung thư bàng quang 7,8, thể hiện cho một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn. Gen ERBB2 cũng tham gia vào quá trình chuyển đoạn ở bốn khối u, tất cả đều có các đối tác dung hợp khác nhau và tất cả đều được xác nhận bằng giải trình tự DNA, RNA-seq hoặc cả hai. Trong một trường hợp, các exon 4 đến 29 của ERBB2 được hợp nhất với promoter cộng với exon 1 của DIP2B, và sản phẩm dung hợp được khuếch đại (Hình 2b). Hai sản phẩm dung hợp khác dẫn đến các sản phẩm mRNA mới, ý nghĩa về mặt sinh học của chúng chưa được nghiên cứu.

[Hình 2: Sự sắp xếp lại cấu trúc và tích hợp virus]

a, Sự dung hợp FGFR3 – TACC3 trong mẫu TCGA-CF-A3MH cho thấy các điểm ngắt quãng trong hai gen, trình tự tiếp giáp điểm đứt và protein dung hợp được dự đoán. b, Sắp xếp lại liên quan đến DIP2B và ERBB2 trong TCGA-DK-A2I6. Gen ERBB2 đã hoán đổi promoter của nó với gen của DIP2B, dẫn đến sự biểu hiện quá mức của ERBB2. c, Thêm lượng virus u nhú ở người 16 (HPV16) vào gen BCL2L1 trên nhiễm sắc thể 20 ở TCGA-GC-A3I6. Vùng BCL2L1 mà vi rút đã tích hợp và trình tự tiếp giáp tích hợp được hiển thị.

Chúng tôi đã xác định được DNA của virus ở 7 trong số 122 khối u (6%) và bản sao của virus ở 5 trong số 122 (4%). Ba khối u biểu hiện phiên mã cytomegalovirus (CMV) (mã hóa RL5A, RNA2.7, RL9A, RNA1.2, UL5 và UL22A), một biểu hiện virus BK polyoma và một biểu hiện virus u nhú ở người 16 (HPV16). HPV16 và DNA nhiễm trùng herpesvirus 6B ở người từng được xác định trong một mẫu khác nhưng không có biểu hiện. Không có khối u nào biểu hiện CMV cho thấy bằng chứng về sự tích hợp CMV vào bộ gen của vật chủ, cho thấy sự hiện diện của một đoạn ổn định. Trong khối u dương tính với BK, hai gen BK được tích hợp vào GRB14, một protein điều hợp tín hiệu cho các tyrosine kinase thụ thể. Trong trường hợp biểu hiện HPV-16, vi rút này tích hợp vào BCL2L1, một gen điều hòa quá trình apoptosis (Hình 2c). Trong khối u đó, BCL2L1 được khuếch đại (∼6 ×) và thể hiện quá mức (∼10 × trung vị;> 2 × bất kỳ mẫu nào khác). Nhìn chung, những phát hiện này chỉ ra rằng nhiễm virus có thể có vai trò trong sự phát triển của một tỷ lệ nhỏ ung thư biểu mô.

Thông tin biểu hiện của mRNA, miRNA và protein

Phân tích dữ liệu RNA-seq từ 129 khối u đã xác định được bốn cụm (cụm I-IV) (Hình 3 và Hình bổ sung. 4.1). Cụm I (‘giống nhú’) phát triển trong các khối u có hình thái nhú (P = 0,0002), đột biến FGFR3 (P = 0,0007, q = 0,02), tăng số lượng bản sao FGFR3 (P = 0,04, q = 0,1) và FGFR3 tăng cao biểu thức (P <0,0001) (Hình 3a). Nó bao gồm cả ba mẫu có hợp nhất FGFR3 – TACC3. Các mẫu cụm I cũng cho thấy sự biểu hiện thấp hơn đáng kể của miR-99a và miR-100, các miRNA điều chỉnh giảm sự biểu hiện FGFR3 (P = 0,0002, Hình 3a và Hình bổ sung. 5.3) 22. Các mẫu cụm I cũng cho thấy biểu hiện của miR-145 và miR-125b thấp hơn, điều này chứng minh mức độ thường xuyên bị kiểm soát trong ung thư bàng quang 23. Các khối u có biến đổi FGFR3 và có thể là các khối u khác có chung cấu trúc biểu hiện cụm I, có thể đáp ứng các chất ức chế FGFR hoặc cùng cấu trúc.

[Hình 3: Đặc điểm biểu hiện của ung thư bàng quang]

Phân tích tích hợp dữ liệu mRNA, miRNA và protein dẫn đến việc xác định các tập hợp con riêng biệt của ung thư biểu mô. Dữ liệu về mRNA, miRNA và protein đã được chuẩn hóa z và các mẫu được sắp xếp theo hướng ngang bằng cách phân cụm mRNA. a, Mô học nhú, thay đổi FGFR3, biểu hiện FGFR3 và giảm biểu hiện miRNA liên quan đến FGFR3 được thể hiện trong cụm I. b, Sự biểu hiện của các gen dòng biểu mô và các cytokeratins của thân / tổ tiên nói chung cao ở cụm III, một số gen trong đó là biểu mô tế bào vẩy. c, Các yếu tố biệt hóa vú và niệu quản được hình thành ở cụm I và II. d, đột biến ERBB2 và biểu hiện beta thụ thể estrogen (ESR2) được hình thành ở các cụm I và II.

Dữ liệu về loại protein đảo ngược triệu chứng(RPPA) chỉ ra rằng cụm I và II biểu hiện mức HER2 (ERBB2) cao và đặc điểm thể hiệu thụ thể estrogen tăng cao (ESR2), cho thấy các mục tiêu tiềm năng về các liệu pháp hormone như tamoxifen hoặc raloxifene (Hình. 3d) . Trên thực tế, mức độ protein HER2 trong một tập hợp con của các khối u có thể so sánh với mức độ được tìm thấy trong bệnh ung thư vú có TCGA HER2 dương tính 23.

Để so sánh, chúng tôi đã đặt câu hỏi liệu có bất kỳ cụm nào trong số bốn cụm hiển hiện dấu hiệu gen tương tự như những dấu hiệu được xác định trong bất kỳ (các) loại khối u nào khác trong số 11 cụm đầu tiên được phân tích bởi Bản đồ bộ gen ung thư  TCGA hay không. Chúng tôi nhận thấy rằng dấu hiệu của cụm ung thư bàng quang III (‘dạng đáy / dạng vảy’) tương tự như dấu hiệu của ung thư vú dạng đáy, cũng như ung thư tế bào vảy của đầu, cổ và phổi (Hình bổ sung 4.2) ^{24 , 25}. Tất cả bốn loại ung thư đó đều biểu hiện các gen dòng dõi biểu mô đặc trưng, ​​bao gồm KRT14, KRT5, KRT6A và EGFR. Loại phụ 26 tế bào gốc và loại tế bào vảy 27 của ung thư biểu mô biểu mô đã được nghiên cứu một cách độc lập. Nhiều mẫu trong cụm bàng quang III biểu hiện cytokeratins (nghĩa là KRT14 và KRT5) gần đây đã được nghiên cứu để phân biệt tế bào gốc / tế bào tiền thân 26. Một số mẫu đó cũng cho thấy một mức độ mô học vảy biến thể (Hình 3b). Các cụm bàng quang I và II có các đặc điểm tương tự như của ung thư vú loại A, với biểu hiện mRNA và protein cao của các dấu hiệu phân biệt ung thư vú, bao gồm GATA3 và FOXA1 (Hình 3c). Các dấu hiệu phân biệt biểu mô như uroplakin (ví dụ, UPK3A) cũng được biểu hiện nhiều trong các cụm I và II, cũng như dấu hiệu biểu mô E-cadherin và các thành viên của họ miRNA miR-200 (nhắm mục tiêu đến nhiều cơ quan – quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô) 28 (Hình 3c). Tổng hợp lại, những quan sát này chỉ ra rằng, mặc dù có nguồn gốc mô đa dạng, một số bệnh ung thư bàng quang, vú, đầu và cổ và phổi có chung các con đường phát triển khối u.

Để xác định xem liệu các cụm dựa trên biểu hiện có thể được nhìn thấy trong các tập dữ liệu khác hay không, chúng tôi đã sử dụng các mẫu ung thư bàng quang xâm lấn cơ từ tham chiếu. ²⁷, phân nhóm chúng theo thứ bậc với các gen được sử dụng trong phân tích của chúng tôi. Từ biểu đồ dendrogram mẫu, chúng tôi xác định được bốn nhóm (Hình bổ sung 4.3a). Bốn nhóm được xác định trong tập dữ liệu của ref. 27 có tương quan với bốn cụm được xác định trong dữ liệu TCGA của chúng tôi (Hình bổ sung 4.3b).

Khi chúng tôi phân tích dữ liệu RNA-seq cho biến thể mối nối phiên mã bằng SpliceSeq29 (Thông tin bổ sung, phần 11), một phát hiện được quan tâm là trung bình 3% bản sao PKM1 và 97% PKM2 trong các mẫu khối u. Đồng dạng PKM2 của pyruvate kinase là yếu tố chính của sự chuyển đổi sang quá trình đường phân hiếu khí trong các khối u (hiệu ứng Warburg) 30. Do đó, ung thư bàng quang niệu quản (và các loại ung thư khác) có thể nhạy cảm với sự ức chế đường phân hoặc các con đường chuyển hóa liên quan.

Phân tích lộ trình và mục tiêu điều trị

Phân tích tổng hợp dữ liệu đột biến và số bản sao cho thấy ba con đường chính thường xuyên không kiểm soát được trong ung thư bàng quang: điều hòa chu kỳ tế bào (bị thay đổi trong 93% trường hợp); kinase và tín hiệu phosphatidylinositol-3-OH kinase (PI (3) K) (72%); và tái cấu trúc nhiễm sắc thể, bao gồm đột biến / CNA xôma trong gen sửa đổi histone (89%) và các thành phần của phức hợp tái cấu trúc nucleosome SWI / SNF (64%) (Hình 4a). Để bổ sung những kết quả này cho các con đường được xác định rõ ràng, chúng tôi đã áp dụng phương pháp phân tích mạng lưới để kiểm tra các tương tác có thể có sự khác biệt giữa các gen và con đường (Hình 4b). Đặc biệt, chúng tôi đã sử dụng thuật toán TieDIE để tìm kiếm các tương tác điều tiết quan hệ nhân quả trong mạng PARADIGM, mạng này kết nối các gen đột biến với các trung tâm phiên mã đang hoạt động ^31,32. Phân tích đã xác định một mạng con liên kết các gen sửa đổi histone bị đột biến với một loạt lớn các yếu tố phiên mã được kích hoạt, cho thấy tác động sâu rộng tiềm tàng của việc sửa đổi histone trên các con đường khác (Hình 8.2.1) hội tụ trên cơ chế điều hòa MYC / MAX. Cả MYC và MAX đều cho thấy mức độ hoạt động bằng cách tương tự, không phụ thuộc vào đột biến ở gen nhiễm sắc thể, cho thấy rằng đột biến trong gen sửa đổi histone chỉ cung cấp một cơ chế để phá vỡ trung tâm MYC / MAX. Ngược lại, các khối u có đột biến liên quan đến nhiễm sắc thể cho thấy các yếu tố phiên mã FOXA2 và SP1 hoạt động khác biệt, liên quan đến quá trình khử biệt hóa do kết quả của các đột biến. Phương pháp phân tích mạng lưới của chúng tôi cũng xác định HSP90AA1 là một trung tâm tín hiệu quan trọng, chỉ ra rằng các chất ức chế HSP90 có thể có giá trị điều trị trong ung thư biểu mô niệu quản. Mặc dù mối liên hệ giữa các đột biến và các thay đổi phiên mã có ý nghĩa thống kê về mức độ gần nhau của chúng trong mạng lưới (như được xác định bằng các phép thử hoán vị; xem Hình 8.2 bổ sung), các nghiên cứu sâu hơn sẽ cần thiết cho việc đánh giá mức độ liên quan sinh học của các phát hiện.

[Hình 4: Các đường dẫn và mạng lưới bị thay đổi trong ung thư bàng quang.]

a, Đột biến xôma và thay đổi số lượng bản sao (CNA) trong các thành phần của con đường p53 / Rb, con đường RTK / RAS / PI (3) K, biến đổi histone và phức hợp SWI / SNF. Màu đỏ, kích hoạt các biến đổi gen; màu xanh lam, làm vô hiệu hóa các biến đổi gen. Phần trăm được hiển thị hoạt động hoặc vô hiệu hóa của ít nhất một alen. b, Mạng kết nối các gen biến đổi mô bị đột biến với các yếu tố phiên mã có hoạt tính khác biệt (phương pháp luận và mạng lưới liên quan lớn hơn trong Hình 8.2.1). Mỗi gen được mô tả như một vòng tròn nhiều vòng với nhiều mức dữ liệu khác nhau, được vẽ sao cho mỗi ‘gen’ trong vòng biểu thị một mẫu bệnh phẩm duy nhất (cùng một thứ tự mẫu cho tất cả các gen). Vòng ‘PARADIGM’, mức độ hoạt động gen được suy ra theo định dạng sinh học (màu đỏ, hoạt động cao hơn); “Hoạt động phiên mã”, mức mRNA trung bình của tất cả các mục tiêu của mỗi yếu tố phiên mã; ‘Biểu hiện’, mức mRNA so với bình thường (đỏ, cao); ‘Đột biến gen’, đột biến xôma; ‘Đột biến ở các gen sửa đổi histone’, đột biến xôma ở ít nhất một gen như vậy; ‘IPL chống tương quan’, các gen có mức độ con đường tích hợp PARADIGM (IPL) tương quan nghịch với tình trạng đột biến gen-histone. Mối quan hệ gen-gen được suy ra bằng cách sử dụng các nguồn lớn.

Phân tích tổng hợp cũng xác định các đột biến, thay đổi số lượng bản sao hoặc thay đổi biểu hiện RNA ảnh hưởng đến con đường PI (3) K / AKT / mTOR ở 42% khối u (Hình 5a). Bao gồm các đột biến điểm trong PIK3CA (17%; có khả năng đáp ứng với các chất ức chế PI (3) K), đột biến hoặc xóa TSC1 hoặc TSC2 (9%; có khả năng đáp ứng với các chất ức chế mTOR) và biểu hiện quá mức AKT3 (10%; có khả năng đáp ứng với Chất ức chế AKT). Chúng tôi cũng quan sát thấy các đột biến, khuếch đại bộ gen hoặc hợp nhất gen ảnh hưởng đến con đường RTK / RAS ở 44% các khối u (Hình 5b, c). Bao gồm yếu tố có thể kích hoạt FGFR3 (17%; có khả năng đáp ứng với chất ức chế hoặc kháng thể FGFR), khuếch đại EGFR (9%; có khả năng đáp ứng với kháng thể hoặc chất ức chế EGFR), đột biến của ERBB3 (6%; có khả năng nhạy cảm với chất ức chế ERBB kinase) và đột biến hoặc khuếch đại ERBB2 (9%; có khả năng nhạy cảm với chất ức chế hoặc kháng thể kinase ERBB2). Các đột biến ERBB3 trong ung thư bàng quang đã được ghi nhận trước đây4, nhưng đột biến có ý nghĩa thống kê của ERBB2 trong ung thư bàng quang chưa được công bố. Cả hai gen đều là mục tiêu điều trị tiềm năng trong các bệnh khác^33,34,35. Đáng chú ý, các thay đổi ERBB2 trong nghiên cứu này gần như thường xuyên như trong ung thư vú TCGA, nhưng ít khuếch đại hơn và nhiều đột biến hơn (Hình 5d) ^24.

[Hình 5: Các mục tiêu tiềm ẩn trong ung thư bàng quang]

a, Những thay đổi trong con đường PI (3) K / AKT / mTOR là loại trừ lẫn nhau. Các mẫu khối u được thể hiện trong các cột; gen thành hàng. Chỉ các mẫu có ít nhất một thay đổi mới được hiển thị. AKT3 cho thấy biểu hiện tăng cao trong 10% số mẫu, không phụ thuộc vào số bản sao (bảng điều khiển bên phải). Thể dị bội, giảm phân dị hợp. b, Các tyrosine kinase thụ thể bị thay đổi, bởi bất kỳ cơ chế nào trong số một số cơ chế khác nhau (khuếch đại, đột biến hoặc hợp nhất), trong 45% mẫu. Chỉ các đột biến được lặp lại trong tập dữ liệu này hoặc được đưa ra trước đó trong COSMIC mới được hiển thị. c, Đột biến lặp lại ở ERBB2 và ERBB3. Các đột biến được hiển thị bằng màu đen hoặc tái diễn trong tập dữ liệu TCGA hoặc được báo cáo trong COSMIC. Màu lục, miền L thụ thể; vùng giàu cysteine ​​màu đỏ, giống như furin; màu xanh lam, miền thụ thể yếu tố tăng trưởng IV; màu vàng, miền tyrosine kinase. d, Khuếch đại ERBB2 và đột biến tái phát trong các bệnh ung thư khác được TCGA mô tả. Các đột biến lệch bội được đếm ở các vị trí sau: G309, S310, L313, R678, T733, L755, V777, D769, V842, T862, R896 và M916I. Số lượng chèn trong khung được đếm giữa các axit amin 774 và 776. Chỉ các loại khối u có tần suất thay đổi ≥2% mới được hiển thị.

Thảo luận

Nghiên cứu tổng hợp về ¹³¹ ung thư biểu mô bàng quang xâm lấn này cung cấp nhiều phát hiện mới về yếu tố sinh học của bệnh và phác thảo nhiều cơ hội tiềm năng đối với việc can thiệp điều trị. Điều trị ung thư bàng quang xâm lấn cơ không có nhiều tiến bộ ngoài hóa trị và phẫu thuật kết hợp dựa trên cisplatin trong 30 năm qua ³⁶, và không có loại thuốc mới nào cho căn bệnh này đã được chấp thuận trong thời gian đó. Thời gian sống trung bình của bệnh nhân ung thư bàng quang tái phát hoặc di căn là 14-15 tháng với hóa trị liệu dựa trên cisplatin, và không có liệu pháp điều trị thứ hai được công nhận rộng rãi ³⁷. Ngoại trừ một báo cáo trường hợp duy nhất, việc điều trị bằng các tác nhân được nhắm mục tiêu cũng không có lợi, mới hơn ³⁸. Một số thay đổi bộ gen được xác định trong nghiên cứu này, đặc biệt là những thay đổi liên quan đến PI (3) K / AKT / mTOR, CDKN2A / CDK4 / CCND1 và con đường RTK / RAS, bao gồm ERBB2 (Her-2), ERBB3 và FGFR3, có thể điều chỉnh được trong nguyên tắc nhắm mục tiêu điều trị. Các thử nghiệm lâm sàng dựa trên những bệnh nhân bị thay đổi bộ gen có thể gây nghiện có liên quan được đảm bảo.

Đột biến FGFR3 là đặc điểm chung của ung thư bàng quang biểu mô nhú không xâm lấn cấp độ thấp, nhưng xảy ra với tần suất thấp hơn nhiều ở ung thư bàng quang xâm lấn cấp độ cao. Phân tích cụm trong Hình 3 nêu bật nhiều cơ chế kích hoạt FGFR3, và mối liên hệ chặt chẽ của nó với hình thái u nhú. Dữ liệu được trình bày ở đây gợi ý một tập hợp con các bệnh ung thư xâm lấn cơ có thể được nhắm mục tiêu thông qua FGFR3. Tương tự, khuếch đại ERBB2 có thể nhắm mục tiêu bằng các chiến lược được sử dụng trong ung thư vú, bằng các chất ức chế tyrosine kinase phân tử nhỏ hoặc bằng các phương pháp điều trị miễn dịch mới (NCT01353222) 34. Dữ liệu ở đây cung cấp hỗ trợ thêm cho một số thử nghiệm nhắm mục tiêu ERBB2 đang diễn ra ở bệnh ung thư bàng quang và xác định rõ hơn đối tượng của bệnh ung thư phù hợp với phương pháp đó. Cuối cùng, cụm III của phân tích hồ sơ biểu hiện tích hợp cho thấy sự tồn tại của một loại phụ ung thư biểu mô với các đặc điểm biểu hiện tế bào gốc ung thư (bao gồm KRT14 và KRT5), có lẽ cung cấp một con đường khác cho việc nhắm mục tiêu điều trị.

Những thay đổi được xác định trong các con đường biểu sinh cũng gợi mở những khả năng mới trong điều trị ung thư bàng quang. ⁹⁹ (76%) khối u được phân tích ở đây có đột biến bất hoạt ở một hoặc nhiều gen quy định chất nhiễm sắc, và ⁵³ (41%) có ít nhất hai đột biến như vậy. Nhìn chung, các bệnh ung thư bàng quang cho thấy một phổ đột biến rất phong phú với các đột biến trong gen điều hòa nhiễm sắc thể (Bảng bổ sung 2.10). Hơn nữa, các phân tích mạng tích hợp cho thấy tác động sâu sắc của những đột biến đó lên mức độ hoạt động của các yếu tố phiên mã khác nhau và các con đường liên quan đến ung thư. Các loại thuốc nhắm mục tiêu vào các biến đổi nhiễm sắc – ví dụ, các tác nhân được phát triển gần đây liên kết các mô liên kết acetyl-lysine (bromodomains) – có thể chứng minh lợi ích đối với việc điều trị tập hợp con các khối u bàng quang có biểu hiện bất thường trong các enzym điều chỉnh nhiễm sắc thể ³⁹. Các phát hiện của chúng tôi nói chung cho thấy ung thư bàng quang là một nguồn nghiên cứu hàng đầu để khám phá phương pháp điều trị đó.

Tóm tắt phương pháp

Các mẫu khối u và mẫu phẩm bình thường được lấy với sự đồng ý của hội đồng quản trị và cơ quan xét duyệt và được xử lý bằng cách sử dụng bộ AllPrep đã sửa đổi (Qiagen) để thu được DNA và RNA tinh khiết. Các phân tích kiểm soát chất lượng chỉ phát hiện các tác động hàng loạt khiêm tốn (Thông tin bổ sung, phần ‘Hiệu ứng hàng loạt’). Các khối u được xác định bằng cách sử dụng các microarrays Affymetrix SNP 6.0 cho CNA soma, WGS thông thấp (HiSeq) cho CNA xôma và chuyển vị, RNA-seq (HiSeq) cho biểu hiện mRNA và miRNA, mảng Illumina Infinium (HumanMethylation450) để methyl hóa DNA, HiSeq cho giải trình tự exome và RPPA để biểu hiện protein và quá trình phosphoryl hóa. Phân tích thống kê và giải thích sinh học của dữ liệu là mũi nhọn của các trung tâm phân tích dữ liệu bộ gen của dự án bản đồ gen người TCGA. Tệp trình tự có trong CGHub (https://cghub.ucsc.edu/). Tất cả các dữ liệu phân tử, lâm sàng và bệnh lý khác đều có sẵn thông qua Cổng dữ liệu TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Dữ liệu có thể được khám phá thông qua một bản tóm tắt các bản đồ nhiệt được phân nhóm thế hệ tiếp theo (http://bioinformatics.mdanderson.org/TCGA/NGCHMPortal/), cBio Cancer Genomics Portal (http://cbioportal.org), TieDIE (http : //sysbiowiki.soe.ucsc.edu/tiedie), SpliceSeq (http://bioinformatics.mdanderson.org/main/SpliceSeq:Overview), Trình đánh giá hiệu ứng hàng loạt MBatch (http://bioinformatics.mdanderson.org/tcgambatch/ ) và Regulome Explorer (http://explorer.cancerregulome.org/). Cũng xem Thông tin bổ sung.

Nguồn: https://www.nature.com/articles/nature12965

0