Xét nghiệm HbA1c trên nguyên lý điện di mao quản

1. HbA1c là gì

HbA là loại hemoglobin (protein có vai trò vận chuyển oxy trong máu, nằm trong hồng cầu) chính ở người trưởng thành bình thường với cấu trúc gồm 2 chuỗi alpha globin và 2 chuỗi beta globin.

Trong thời gian tồn tại, HbA phản ứng với các phân tử đường trong máu, tạo nên HbA1c là HbA bị đường (glucose) gắn vào vị trí tận cùng của chuỗi beta globin. Càng nhiều glucose trong máu, thì càng có nhiều glucose gắn vào hemoglobin, dẫn đến mức HbA1c cao hơn.

Vì hồng cầu sống trong khoảng 2-3 tháng, nên mức độ HbA1c trong máu phản ánh mức độ đường huyết trung bình trong thời gian đó. Đây là một điều quan trọng vì mức HbA1c không thay đổi nhanh chóng như đường huyết, vì thế nó giúp đánh giá mức độ ổn định của lượng đường trong máu trong một khoảng thời gian dài, thay vì chỉ phản ánh tình trạng đường huyết tại một thời điểm cụ thể.

2. Các nguyên lý xét nghiệm HbA1c

Từ những năm 1970, HbA1c đã được đưa vào nghiên cứu lâm sàng và đến nay được xem là chỉ số cốt lõi trong quản lý bệnh đái tháo đường. Có nhiều nguyên lý khác nhau có thể dùng cho xét nghiệm HbA1c được công nhận bởi NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program – Chương trình chuẩn hóa Glycohemoglobin quốc gia của Mỹ) và IFCC (Liên đoàn Hóa sinh Lâm sàng Quốc tế).

– Sắc kí lỏng hiệu năng cao trao đổi ion (ion exchange HPLC): Dựa vào sự khác biệt về điện tích để phân tách các loại hemoglobin trong cột sắc kí, sau đó định lượng và tính tỉ lệ % HbA1c. Hiện tại, kỹ thuật này cho độ phân giải tương đối cao cũng như có khả năng phân tách và phát hiện một số biến thể hemoglobin phổ biến.

– Sắc kí ái lực boronate: dựa vào ái lực đặc hiệu giữa acid boronic và gốc đường trên các phân tử hemoglobin bị gắn đường (bao gồm cả HbA1c và các loại hemoglobin gắn đường khác), sau đó suy ra %HbA1c dựa vào công thức thực nghiệm. Do không trực tiếp đo HbA1c, phương pháp này không có khả năng phát hiện các biến thể huyết sắc tố.

– Miễn dịch: dựa vào kháng thể đặc hiệu với vị trí gắn HbA1c, khi các kháng thể này kết hợp với HbA1c theo phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể sẽ làm tăng độ đục, đo sự thay đổi độ đục dựa vào lượng ánh sáng có thể đi qua sẽ biết được nồng độ HbA1c trong mẫu, đo lượng huyết sắc tố của mẫu và chia lượng HbA1c cho lượng huyết sắc tố sẽ có đựợc %HbA1c. Phương pháp này có khả năng phát hiện các biến thể huyết sắc tố kém do kháng thể sử dụng chỉ kháng lại một phần nhỏ của phân tử HbA1c, ngoài ra phương pháp bị nhiễu khi huyết tương đục do cần đến 2 lần đo quang để xác định nồng độ HbA1c và nồng độ huyết sắc tố.

– Phương pháp enzymatic: sử dụng enzym đặc hiệu để thủy phân HbA1c tại vị trí aminoacid bị gắn đường và đo sản phẩm phản ứng. tính tỉ lệ giữa sản phẩm phản ứng và lượng huyết sắc tố của mẫu để suy ra %HbA1c. Tương tự phương pháp miễn dịch, phương pháp này ít có khả năng phát hiện biến thể huyết sắc tố cũng như bị nhiễu khi huyết tương đục do cần đến 2 lần đo quang để xác định nồng độ HbA1c và nồng độ huyết sắc tố.

– Phương pháp khối phổ: Sử dụng sự khác biệt khối lượng phân tử cũng như điện tích để phân tách. Cho khả năng phân tách riêng biệt rất tốt các loại huyết sắc tố thông thường cũng như biến thể, là tiêu chuẩn vàng cho định lượng HbA1c hiện nay. Tuy nhiên do yêu cầu đặc biệt về thiết bị nên phương pháp này hầu như không được sử dụng cho xét nghiệm HbA1c với mục đích chẩn đoán, điều trị.

– Điện di mao quản: sử dụng sự khác biệt về kích thước phân tử và điện tích để phân tách.

3. HbA1c trên nguyên lý điện di mao quản

3.1. Nguyên lý điện di mao quản

Nguyên lý điện di mao quản (capillary electrophoresis, CE) là một kỹ thuật phân tích dùng để tách các thành phần trong một hỗn hợp dựa trên sự di chuyển của các phân tử dưới tác dụng của điện trường trong một mao quản (ống nhỏ). Quá trình này dựa trên sự khác biệt về điện tích và kích thước của các phân tử khi chúng di chuyển trong một dung dịch đệm dưới tác động của điện trường.

Khi một điện trường được áp dụng, các ion trong dung dịch sẽ di chuyển theo hướng tương ứng với điện tích của chúng. Các phân tử mang điện tích dương sẽ di chuyển về cực âm, trong khi các phân tử mang điện tích âm sẽ di chuyển về cực dương. Tuy nhiên, tốc độ di chuyển của các phân tử này không giống nhau, vì nó còn phụ thuộc vào các yếu tố như kích thước phân tử, điện tích và độ nhớt của dung dịch. Các phân tử có điện tích lớn hoặc nhỏ, hoặc phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn so với các phân tử khác.

Nhờ các đặc điểm của ống mao quản, dung dịch trong ống mao quản di chuyển theo dạng phẳng thay vì dạng parabol như trong nguyên lý sắc kí lỏng cao áp, tăng khả năng phân tách.
Hình 1. Dạng dòng chảy và ưu thế về khả năng phân tách của điện di mao quản so với HPLC

Điện di mao quản có nhiều ứng dụng, đặc biệt là trong phân tích sinh học, hóa học và dược phẩm. kĩ thuật này thường được sử dụng để phân tách các protein, axit nucleic, và các hợp chất khác với độ nhạy cao, độ chính xác tốt và khả năng tách rất hiệu quả ngay cả đối với những phân tử có kích thước và điện tích gần nhau.

3.2. HbA1c trên nguyên lý điện di mao quản
Hình 2. Biểu đồ sắc ký của HbA1c với phương pháp điện di mao quản (trái) và sắc kí lỏng cao áp (trái).

Trên nguyên lý điện di mao quản, mẫu máu cần được xét nghiệm sẽ được ly giải để phá vỡ hồng cầu, giải phóng hemoglobin tự do, hỗn hợp sau đó được trộn với dung dịch đệm (buffer) để tạo pH kiềm, vào đưa vào ống mao quản để thực hiện điện di với hiệu điện thế cao.

HbA1c được phân tách riêng biệt với các loại hemoglobin cũng như hemoglobin gắn đường khác, cho phép định lượng chính xác tỉ lệ HbA1c. Các yếu tố nhiễu sinh học do các bất thường về hemoglobin như tăng HbF trong beta thalassemia, xuất hiện HbH trong alpha thalassemia có thể được phát hiện dễ dàng, các biến thể huyết sắc tố thường gặp như HbE, HbCs, HbD, HbS đều có dạng biểu đồ đặc trưng riêng, không trùng với các đỉnh HbA1c hay HbAo, từ đó đảm bảo phát hiện các yếu tố này và đảm bảo không bị nhiễu trong các trường hợp  kết quả HbA1c vẫn có thể được sử dụng trong chẩn đoán và điều trị đái tháo đường.

4. Các ưu, nhược điểm của HbA1c trên nguyên lý điện di mao quản

Ưu điểm chính của HbA1c trên nguyên lý điện di mao quản là khả năng phân tách rõ ràng nhiều loại biến thể huyết sắc tố cũng như độ phân giải cao, cho phép phát hiện các yếu tố nhiễu sinh học này, tránh trả các kết quả không tương xứng với tình trạng đường huyết, ảnh hưởng đến chẩn đoán và điều trị.

Nhược điểm của điện di mao quản là tốc độ phân tích, do thời gian phân tích cho từng mẫu kéo dài hơn nhiều so với phương pháp phổ biến là sắc kí lỏng hiệu năng cao. Do vậy, để tăng công suất yêu cầu tăng số lượng đầu mao quản của thiết bị phân tích, tuy nhiên do vậy phương pháp này thường không phù hợp với các phòng xét nghiệm cỡ nhỏ do không đảm bảo số lượng mẫu, gây tăng chi phí. Ngoài ra, vẫn có một số biến thể huyết sắc tố hiếm có thể trùng với các đỉnh HbA hoặc HbA1c gây ảnh hưởng kết quả, tuy hiếm gặp hơn so với phương pháp HPLC.

Điện di mao quản chỉ giúp phát hiện các yếu tố gây nhiễu HbA1c, các trường hợp này cần được sử dụng các xét nghiệm khác để theo dõi, điều trị.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Eyth E, Zubair M, Naik R. Hemoglobin A1C. 2025 Jun 2. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2025 Jan–. PMID: 31747223.
2. Mcdevitt, V.L; Rodriguez, A.; Williams, K. R. J. Chem. Educ. 1988, 75(5), 625.
3. Chen Z, Shao L, Jiang M, Ba X, Ma B, Zhou T. Interpretation of HbA1c lies at the intersection of analytical methodology, clinical biochemistry and hematology (Review). Exp Ther Med. 2022;24(6):707. Published 2022 Oct 4. doi:10.3892/etm.2022.11643.
4. International Expert Committee. International Expert Committee report on the role of the A1C assay in the diagnosis of diabetes. Diabetes Care. 2009;32(7):1327-1334. doi:10.2337/dc09-9033.

Tác giả: ThS. BSNT. Nguyễn Công Đăng, BS Xét nghiệm Huyết học, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Vinmec Times City.

0