Người thẩm định: Trương Công Duẩn
Người phê duyệt: Phùng Nam Lâm
Ngày phát hành: 17/01/2022

1.Mục đích

1.1. Mục đích của quy trình

Mục đích của việc viết quy trình này giúp cho nhân viên khoa xét nghiệm thực hiện xét nghiệm điện di huyết sắc tố trên máy Ultra2 variant.

1.2. Mục đích của xét nghiệm điện di huyết sắc tố

Xét nghiệm điện di huyết sắc tố trong máu toàn phần chống đông EDTA giúp chẩn đoán bệnh lý tan máu bẩm sinh di truyền

2. Phạm vi áp dụng

Quy trình này áp dụng cho việc thực hiện xét nghiệm điện di huyết sắc tố trên máy Ultra2 variant tại khoa xét nghiệm.

3. Trách nhiệm

• Lãnh đạo đơn nguyên huyết học có trách nhiệm giám sát nhân viên thực hiện.
• Bác sĩ, Kỹ thuật viên đơn nguyên huyết học đã được đào tạo thực hiện xét nghiệm theo quy trình 

4. Định nghĩa- Từ viết tắt 

• Hb: Hemoglobin (huyết sắc tố).
• EDTA: Ethylen dialmine tetra-acetic acid.
• QC: Quality control.

5. Chuẩn bị bệnh nhân/ Mẫu bệnh phẩm

5.1. Chuẩn bị bệnh nhân: Có thể lấy máu bất kỳ thời điểm nào trong ngày.

5.2. Dụng cụ chứa mẫu bệnh phẩm, mẫu bệnh phẩm

Dụng cụ chứa mẫu bệnh phẩm là ống có chất chống đông EDTA. Mẫu bệnh phẩm là máu toàn phần ngoại vi, thể tích tối thiểu 0,5ml. thời gian ổn định mẫu ổn định ≤ 7 ngày khi bảo quản ở 2 – 80C.

6. Trang thiết bị, thuốc thử và vật tư tiêu hao

6.1. Thiết bị

Máy xét nghiệm Ultra2 variant. Máy tính và máy in

6.2. Hoá chất

6.3. Vật tư tiêu hao:

• Lọ mẫu (248 lọ/đơn vị đóng gói).
• Màng lọc Filter Frits 1 μm (10 chiếc/đơn vị đóng gói).
• Cột sắc ký
• Pipet điều chỉnh thể tích (100 – 1000 μL).
• Pipet điều chỉnh thể tích (5 – 100 μL).
• Đầu côn.
• Nước tinh khiết.
• Giá đựng ống nghiệm, ống chống đông EDTA.
• Găng tay cao su, thùng rác.

7. Nguyên tắc/ nguyên lý của quy trình

Nguyên lý sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao.

8. Nguyên tắc an toàn

• Không được để hoá chất tiếp xúc trực tiếp với mắt và da.
• Luôn đeo găng khi xử lý mẫu bệnh phẩm và làm xét nghiệm.
• Khử khuẩn mặt bàn làm việc theo quy định an toàn PXN

9. Các bước thực hiện quy trình

9.1. Chuẩn bị

• Chuẩn bị máy: Kiểm tra và bổ sung tất cả các thuốc thử trên máy gồm Mobil Phase 1, Mobil Phase 2, Wash, 2 Dil, Nước cất…
• Chuẩn bị hóa chất:
  • Chuẩn bị dung dịch FASC:

• Tháo niêm phong và nắp lọ.
• Thêm 1000 µL dung dịch pha loãng 2 Diluent Reagent vào lọ.
• Để lọ chất chuẩn ổn định trong vòng 15 phút, sau đó xoay lọ nhẹ nhàng đến khi chất chuẩn hoàn nguyên hoàn toàn.
• Phân phối vào các ependof thể tích 20 µl, bảo quản ở – 30 đến -20℃ trong thời gian tối đa 1 năm.
• Khi sử dụng để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, hoàn nguyên với 1580µl 2 Diluent Reagent, sử dụng trong 24 h ở nhiệt độ 20- 25℃.

• Chuẩn bị dung dịch QC

• Tháo niêm phong và nắp lọ.
• Thêm 300 µL dung dịch pha loãng 2 Diluent Reagent vào lọ.
• Để lọ chất chuẩn ổn định trong vòng 10 phút, sau đó xoay lọ nhẹ nhàng đến khi chất chuẩn hoàn nguyên hoàn toàn.
• Phân phối vào các ependof thể tích 15 µl, bảo quản ở – 30 đến -20℃ trong thời gian tối đa 90 ngày.
• Khi sử dụng để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, hoàn nguyên với 1785 µl 2 Diluent Reagent, sử dụng trong 24 h ở nhiệt độ 20- 25℃ 

• Chuẩn bị cột sắc ký::

• Mỗi cột sắc ký sử dụng cho 500 lần chạy.
• Cột được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8℃, làm ấm ở nhiệt độ phòng xét nghiệm trước khi lắp vào thiết bị

• Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm
  • Người làm xét nghiệm nhận mẫu bệnh phẩm từ người nhận bệnh phẩm.
  • Kiểm soát mẫu đảm bảo định danh người bệnh trên phiếu chỉ định và mẫu bệnh phẩm trùng nhau, ống lấy đủ máu, không đông.
  • Để mẫu được hút trực tiếp cần thể tích mẫu tối thiểu 1 ml. Trường hợp mẫu ít, mẫu có tình trạng giảm HGB cần pha loãng mẫu (pha loãng 1:200 với dung dịch 2 diluent).

9.2. Thực hiện kỹ thuật

• Bật máy
  • Kiểm tra tất cả các thuốc thử trên máy gồm: Diluent, Mobile Phase 1, 2, Wash, Nước cất… -> Bật máy.
  • Kích vào Main/ Activate system – STANDBY trong 20 phút. Chuẩn bị FASC, QC để chạy trước khi chạy mẫu.
• Chạy FASC: FASC sẽ được tự động chạy đầu mỗi mẻ, hoặc mỗi 20 mẫu bệnh phẩm.
• Chạy QC
  • Vào Main\ Edit sample\ Entering sample ID.
  • Nhập level QC muốn chạy để chạy.
• Chạy mẫu bệnh phẩm
  • Vào Main\ Edit sample\ Entering sample ID.
  • Nhập thông tin người bệnh: Nhập thông qua của sổ SAMPLE NAME – Kích vào Add. Thực hiện các mẫu tiếp theo cho đến khi hết -> DONE. Có thể dùng Barcode để quét.
  • Vào Main\ Run samples -> Chọn phương pháp chạy phù hợp, kiểm tra các thông tin QC sau đó chọn OK, máy sẽ bắt đầu thực hiện phân tích.
• Chạy một mẻ mới tiếp theo
  • Khi chạy xong một mẻ muốn thực hiện mẻ mới tiếp theo phải xoá toàn bộ thông tin của mẻ cũ. Nếu không xóa, máy sẽ thực hiện chạy lại từ đầu.
  • Vào Main\Edit sampled\Entering sample ID, chọn Erase Rack Samples chọn Yes.
  • Thực hiện nhập thông tin người bệnh thông qua của sổ SAMPLE NAME – Kich Add. Thực hiện các mẫu tiếp theo cho đến khi hết -> DONE. Có thể dùng Barcode để quét.
  • Vào Main\ Run samples -> Chọn phương pháp chạy phù hợp (Quick Scan hoặc High Soluion), kiểm tra các thông tin QC sau đó chọn OK, máy bắt đầu thực hiện phân tích.
• Sau khi phân tích máy in ra kết quả.
• Thực hiện rửa máy cuối ngày:
  • Nếu máy đang ở chế độ STANDBY vào Main\ Deactivate System -> shutdown
  • Chuẩn bị dung dịch Bleach – Nước Javen 10 % cho vào vào cóng Bleach trên máy

9.3. Phân tích kết quả

• Bước 1 Kiểm tra biểu đồ kết quả, khi xuất hiện những hiện tượng ngoài giá trị dưới đây cần kiểm tra lại thiết bị, hóa chất, quy trình chuẩn bị mẫu và chạy lại:

• Áp suất phân tích nằm ngoài khoảng 50 – 100 bar, dao động của áp suất trong suất quá trình chạy lớn hơn 8%.
• Tổng diện tích peak: nằm trong giới hạn cho phép. Diện tích tối ưu nằm trong khoảng 1,5 – 2,5 triệu đơn vị.
• Đường baseline phải nằm ngang. Tuy nhiên, lưu ý trong trường hợp mẫu nhũ nhi có thể đường baseline không nằm ngang do đặc điểm của mẫu.
• Các peak khi phân tích có đỉnh nhọn, đối xứng 2 bên, và không được chẻ đôi peak. 
• Khi xuất hiện code 1, cần lưu ý đến tổng diện tích peak, nếu tổng diện tích peak nằm trong giới hạn cho phép, thì cần kiểm tra lại máy, cột, và hóa chất.
• Nếu có cờ báo số 7 và Total area > 3,0 triệu đơn vị thì mẫu tiếp theo cần chạy lại để tránh nhiễm chéo

• Bước 2 Tìm các peak A0; A2, F. Lưu ý:

• Diện tích đỉnh F được tính từ tổng diện tích 2 peak là : F peak và Acetylated F
• Khi xuất hiện code 6: đối với người Việt Nam, thường peak xuất hiện code 6 là HbF.
• Xem diện tích peak A1c có cao không, nếu lớn hơn 10% sẽ xuất hiện code 5. Điều này là hoàn toàn bình thường, bệnh nhân nên được kiểm tra lại trên máy HbA1c để chấn đoán đái tháo đường.
• Tuy nhiên khi diện tích peak A1c cao, thì cũng có thể dẫn tới peak có vị trí RRTA 0.74-0.76 tăng dưới 10%.
• Khi diện tích peak F lớn hơn 10%: RRT- F: 0.90-1.05.
• Khi diện tích peak F nhỏ hơn 10%: RRT- F: 1.00-1.11.

• Bước 3 Tìm các peak lạ, các peak lạ được xác định qua các đặc điểm sau:

• Peak xuất hiện sau peak A2 => sẽ xuất hiện code 4 => yêu cầu chạy lại bằng chế độ high resolution để so sánh với thư viện đột biến.

• Peak xuất hiện sau peak A0 và trước peak A2 => Yêu cầu chạy lại bằng chế độ high resolution để so sánh với thư viện đột biến.
• Khi peak có vị trí nằm ở vị trí A2, nhưng không được máy phân tích đánh dấu là A2, đồng thời có diện tích lớn hơn 10% => Yêu cầu chạy lại bằng chế độ high resolution để so sánh với thư viện đột biến. Trường hợp này cần lưu ý với đột biến HbE.
• Các peak ngoài peak F, A0, A2, A1c và peak đi kèm peak A1c trong trường hợp peak A1c tăng cao (như phân tích bước 2) có xuất hiện code 3, hoặc có diện tích lớn hơn 5%. Cần chạy lại chế độ High Resolution để phân tích và so sánh với thư viện đột biến.
• Các peak có RRT-F nhỏ hơn 0.9, ngoại trừ peak A1c, Acetylated F có diện tích lớn hơn 3%, cần lưu ý và so sánh với HbH và Hb Bart.

• Bước 4

• Trong các peak lạ, tìm peak nào có diện tích lớn nhất. Lấy thông tin về RRT, so sánh với thư viện đột biến, so sánh hình ảnh phân tích để đưa ra nghi ngờ đột biến. 
• Ghi diện tích Peak A2, peak đột biến, HbF, phần diện tích còn lại thuộc về A1.
• Nếu có peak xuất hiện ở vùng của HbS, thì có thể khuyến cáo bệnh nhân kiểm tra thêm để khẳng định.
• Nếu có peak xuất hiện ở vùng của HbS, thì cần kiểm tra thêm xem có các peak đột biến lạ kết hợp hay không, và diện tích của peak Hb S có phải lớn nhất không để kiểm tra xem bệnh nhân có bị hồng cầu hình liềm không. Tuy nhiên cũng cần phân biệt với hemoglobin Tak

10. Kiểm soát chất lượng

10.1. Quy định kiểm soát chất lượng

• Cần bảo dưỡng máy hàng ngày, hàng tuần và hàng tháng theo quy trình bảo dưỡng và xử lý lỗi thường gặp trên máy Ultra2 variant.
• Bảo quản cột sắc ký:
  • Khi sử dụng lần đầu cẩn kiểm tra chất lượng bằng FASC, QC để đảm bảo cột hoạt động tốt.
  • Nếu không sử dụng thiết bị trong khoảng thời gian từ 7 ngày trở lên thì tháo cột trước khi tắt máy, đậy nắp mỗi đầu và bảo quản ở 2 – 8℃. 
  • Nên đảo ngược cột hàng ngày hoặc mỗi 250 lần chạy để duy trì hiệu suất của cột phân tích.
• Kiểm tra chất lượng LOT QC mới bằng cách chạy 3 điểm xác nhận giá trị của nhà sản xuất.

10.2. Nội kiểm tra chất lượng

• Thực hiện theo quy định Kiểm soát chất lượng xét nghiệm.
• Chạy FASC trước khi chạy mẫu bệnh phẩm.
• QC 2 mức mỗi ngày thực hiện xét nghiệm, đối chiếu kết quả QC với giá trị của nhà sản xuất. Ghi chép hồ sơ QC vào biểu đồ Levey Jennings, thực hiện hành động khắc phục khi QC không đạt 

10.3. Ngoại kiểm tra chất lượng 

Thực hiện theo quy định Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm.

11. Diễn giải và báo cáo kết quả

11.1. Tính toán và biện luận kết quả

• Kết quả bình thường 

• Tính tỉ lệ % thành phần huyết sắc tố bình thường căn cứ vào kết quả chạy máy.
• Phê huyệt kết quả theo quy định.

• Kết quả bất thường: 

• Khi phát hiện cảnh báo trên kết quả phân tích, thực hiện kiểm tra lại chất lượng mẫu để loại trừ sai sót do mẫu bị hỏng, kiểm tra lại chất lượng xét nghiệm (FASC, QC). 
• Khi phát hiện các biến thể (S, Cs, Hekinan…) và các biến thể chưa xác định thì khuyến nghị vào báo cáo kết quả “Đề nghị thực hiện xét nghiệm khẳng định”.

11.2.Khoảng tham chiếu: 

HbA1: 96 – 98% HbA2: 2 – 3.5% HbF: < 2%

11.3. Giá trị báo động: Không áp dụng

11.4. Khoảng tuyến tính: Không áp dụng

11.5. Khoảng báo cáo: 

Hb A1: 1- 99% HbA2: 0 -99% HbF: 0 – 99%

11.6. Ý nghĩa lâm sàng

• HbA2 tăng: β thalassemia; Hồng cầu hình liềm; cường giáp
• HbA2 giảm: α thalassemia; delta thalassemia; thiếu sắt/ ngộ độc chì; nhược giáp.
• HbF tăng: HBFH; Beta – delta thalassemia; thai kỳ; đái tháo đường.
• HbE tăng: Bệnh huyết sắc tố E

11.7. Kiểm soát các yếu tố ảnh hưởng/ gây nhiễu

Trường hợp thiếu máu nặng có thể gây sai lệch kết quả, cẩn chạy ở chế độ pha loãng mẫu thủ công

12. Lưu trữ hồ sơ: Lưu kết quả FASC, QC, xét nghiệm từ máy xét nghiệm theo quy định

13. Tài liệu tham khảo

• Tiêu chuẩn ISO 15189:2012(TCVN ISO15189:2014): Phòng thí nghiệm y tế – Yêu cầu cụ thể về chất lượng và năng lực. 
• ARLM 03 (01/2020) – Yêu cầu bổ sung đánh giá phòng xét nghiệm y tế của Văn phòng Công nhận Chất lượng Việt Nam (BoA). 
• Quyết định 5530/QĐ-BYT ban hành 25/12/2015 “về việc hướng dẫn xây dựng quy trình thực hành chuẩn trong quản lý chất lượng xét nghiệm tại các cơ sở khám chữa bệnh”.
• Bộ Y tế (2012), “Quy trình kỹ thuật khám bệnh, chữa bệnh chuyên ngành huyết học – truyền máu – miễn dịch – di truyền”, NXB Y học.
• Ultra2 with ResolutionTM Software ANALYTICAL SYSTEM FOR HEMOGLOBINOPATHIES.
• College of American Pathologists 325 Waukegan Road Northfield, IL 60093-2750www.cap.org 09.17.2019

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó

0