Tăng cường khả năng tương thích miễn dịch của tế bào iPSC bằng cách bất hoạt gen HLA sử dụng công nghệ CRISPR-Cas9

Ngày xuất bản: 02/06/2023

Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC) hứa hẹn sẽ ứng dụng mạnh mẽ trong lĩnh vực y học tái tạo; tuy nhiên, đào thải miễn dịch do không phù hợp HLA vẫn đang là một rào cản lớn trong các ca ghép tế bào đồng loài. Bất hoạt gen B2M và dự trữ nguồn iPSC đồng hợp tử HLA có thể giải quyết vấn đề trên, tuy vậy những phương pháp này có thể dẫn đến kích hoạt của tế bào NK và gây gián đoạn quá trình trình diện kháng nguyên, đồng thời, việc tìm ra người hiến tặng phù hợp cũng rất khó khăn. Trong công bố này, nhóm nghiên cứu đã trình bày hai cách tiếp cận mới dựa trên công nghệ chỉnh sửa gen để tạo ra các dòng iPSC có khả năng tương thích miễn dịch. Hai cách này bao gồm: 1) tạo ra các dòng iPSC giả đồng hợp tự HLA và 2) tạo ra các dòng iPSC bị bất hoạt toàn bộ HLA nhóm I trừ HLA-C. Trong đó với cách 2, nhóm đã tạo ra 12 dòng tế bào iPSC tương thích về mặt miễn dịch với >90% dân số thế giới, tạo điều kiện thuận lợi đáng kể cho các ứng dụng y học tái tạo dựa trên iPSC.

Tổng hợp và lược dịch bởi: TS. Nguyễn Đình Dũng

Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC) được xem như một hướng tiếp cận tiềm năng trong lĩnh vực y học tái tạo. Tuy nhiên, việc ghép đồng loài tế bào biệt hóa từ iPSC có thể dẫn tới kích ứng miễn dịch gây ra bởi khác biệt của kháng nguyên bạch cầu người (HLA). Khác biệt HLA lớp I có thể kích thích tế bào T gây độc CD8+, trong khi đó khác biệt HLA lớp II lại kích hoạt tế bào T helper CD4+ sản xuất cytokine và kích thích các tế bào miễn dịch khác. Mặt khác, các tế bào bị bất hoạt gen beta 2-microglobulin (B2M), để gây gián đoạn hoàn toàn biểu hiện của phần tử HLA, lại bị phát hiện và tiêu diệt bởi tế bào giết tự nhiên (NK). Xu và các đồng nghiệp đã ứng dụng công cụ chỉnh sửa gen để tạo ra các dòng tế bào iPSC bị bất hoạt HLA khác nhau nhằm đánh giá khả năng đáp ứng với tế bào T và NK.

Các gen HLA trong các dòng tế bào iPSC (HLA-KO-iPSC) bị bất hoạt bằng phương pháp biến nạp các gRNA dẫn đường đặc chế và protein CRISPR-Cas9. Yếu tố hoạt tử khối u alpha (TNF-α) được sử dụng để tăng cường mức độ biểu hiện của HLA trên iPSC, phục vụ việc phân tách các loại tế bào mong muốn. Tất cả các tế bào miễn dịch phân lập từ tế bào bạch cầu (PBMC) của người hiến mang bộ HLA tương đồng không hoàn toàn với các mẫu tế bào iPSC. Sau đó, tế bào iPSC biệt hóa thành tế bào máu CD43+ và đồng nuôi cấy với tế bào miễn dịch của người hiến (bao gồm T CD8+, NK và các tế bào miễn dịch khác). Ảnh hưởng của HLA-KO iPSC trên quá trình tăng sinh và hoạt động của tế bào miễn dịch được đánh giá bằng phương pháp Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) và Chromium-51 (51Cr). Các kết quả cho thấy tế bào máu CD43+ có nguồn gốc từ iPSC không bất hoạt HLA (WT-iPSC) kích thích hoạt tính của tế bào T CD8+, trong khi các tế bào đã bất hoạt HLA như HLA-A-, B-, C+ và B2M-KO thì không. Bên cạnh đó, một nhóm nhỏ tế bào NK lại có phản ứng với tế bào B2M-KO, hiện tượng này không xuất hiện đối với tế bào WT và HLA-A-, B-, C+ trên cả mô hình in vitro và in vivo. Như vậy, việc lược bỏ HLA-A và -B cho thấy hiệu quả trong lẫn tránh tế bào T và duy trì HLA-C (đồng thơi giữ nguyên HLA-E, -F, and –G) là đủ để ngăn chặn tế bào NK bị kích hoạt và tấn công.

Hai cách tiếp cận mới dựa trên công nghệ chỉnh sửa gen để tạo ra các dòng iPSC có khả năng tương thích miễn dịch, bao gồm: 1) tạo ra các dòng iPSC giả đồng hợp tử HLA và 2) tạo ra các dòng iPSC bị bất hoạt toàn bộ HLA nhóm I trừ HLA-C

Tuy nhiên, hệ miễn dịch vẫn có thể bị kích thích bởi tế bào T CD4+ helper sau khi nhận ra sự thiếu tương đồng của HLA lớp II. Việc bất hoạt gen CIITA giúp ngăn chặn biểu hiện của phức hợp MHC lớp II trên tế bào HLA-KO iPSC. Bằng cách bất hoạt biểu hiện của HLA lớp II, tế bào CIITA-HLA-KO và duy trì HLA-C đã không kích thích tăng sinh của tế bào CD4+ helper.

Cuối cùng, nhóm nghiên cứ đánh giá tính an toàn của phương pháp chỉnh sửa gen thông qua các thí nghiệm đánh giá độ toàn vẹn của hệ gen, bao gồm lập công thức nhiễm sắc thể và phân tích trình tình toàn bộ exome (WES). Các kết quả về tính toàn vẹn của hệ gen cho thấy 1 trong số 15 tế bào đã sửa gen có xuất hiện bất thường ở mức độ nhiễm sắc thể , trong khi đó, hầu hết các biến dị đơn nucleotide (SNV) hoặc indel tìm thấy được xác định là không liên quan đến tác động gây bởi hệ thống phức hệ Cas9/gRNA.

Trong nghiên cứu này, tế bào iPSC bị bất hoạt HLA-A/B, CIITA và bảo toàn HLA-C đã lẫn tránh sự tấn công/ kích hoạt của tế bào T CD8+, T CD4+ và NK. Đội ngũ nghiên cứu đã tạo ra 12 dòng tế bào iPSC có mang các loại HLA-C phổ biến và phù hợp cho hơn 90% các nhóm chủng tộc phổ biến. Nghiên cứu này có thể mở rộng theo hướng đánh giá phản ứng miễn dịch trên các dòng tế bào khác được biệt hóa từ iPSC bao gồm tế bào tim hay thần kinh. Bên cạnh đó, một số bệnh tự miễn như viêm cột sống dính khớp hay đái tháo đường tuýp 1, đều có liên quan chặt chẽ đến HLA-A và -B. Vì vậy, việc bất hoạt các HLA liên quan đến bệnh và giữ nguyên HLA-C có thể trở thành một phương pháp tiếp cận mới cho nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng để điều trị các căn bệnh trên.