Hướng dẫn thực hiện quy trình kỹ thuật xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2 bằng Kit SVNT

• Người thẩm định: Hội đồng khoa học Trung tâm Ứng dụng YHTT&CNC
• Người phê duyệt: Giám đốc Trung tâm Ứng dụng YHTT&CNC
• Ngày phát hành: 14/07/2022
• Ngày hiệu chỉnh: 16/07/2022

1. Mục đích xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

Hướng dẫn cho chuyên viên và kỹ thuật viên nhóm QC, Trung tâm Ứng dụng YHTT&CNC thực hiện kỹ thuật xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa vi-rút SARS CoV 2

Xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2 bằng Kit SVNT

2. Nguyên lý xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

Vùng RBD trên protein gai của vi-rút có chức năng nhận biết thụ thể hACE2 trên bề mặt tế bào người để thực hiện quá trình xâm nhiễm. Phản ứng liên kết giữa RBD và hACE2 sẽ bị phá vỡ bằng kháng thể trung hòa, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi rút. Phương pháp sử dụng nguyên lý của kỹ thuật ELISA, nhằm xác định lượng kháng thể trung hòa có trong mẫu xét nghiệm. Bộ kit SARS-CoV-2 sVNT gồm hai thành phần chính: cộng hợp HRP-RBD và protein ACE2 người (hACE2). Kháng thể trung hoà virus SARS CoV 2 (nếu có) trong mẫu xét nghiệm sẽ ức chế tương tác giữa hACE2 và HRP-RBD. Cộng hợp HRP-RBD được ủ với mẫu xét nghiệm để kháng thể trung hoà (nếu có) trong mẫu sẽ gắn vào HRP-RBD ngăn chặn sự gắn kết của nó với hACE2 khi hỗn hợp sau ủ được nhỏ đĩa đã phủ protein hACE2. Phức hợp kháng thể trung hòa gắn HRP-RBD sẽ được loại bỏ sau khi rửa. Nếu HRPRBD không gắn với kháng thể trung hòa sẽ được gắn vào hACE2 trên đĩa và sẽ được giữ lại sau khi rửa và sẽ phản ứng với cơ chất TMB để phản ứng chuyển thành màu xanh. Dung dịch dừng phản ứng sẽ làm phản ứng đổi sang màu vàng. Đọc kết quả ở bước sóng 450nm.

3. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

• Không có

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

Lưu ý: Trong trường hợp khẩn cấp, các vật liệu trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm có đặc tính và độ an toàn tương đương.

4.3. Hóa chất

Lưu ý: Trong trường hợp khẩn cấp, các vật liệu trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm có đặc tính và độ an toàn tương đương.

5. An toàn

• Nhân viên mới thực hiện quy trình dưới sự hướng dẫn và quan sát của các chuyên viên hướng dẫn trước khi thực hiện một mình bên trong phòng thí nghiệm.
• Đảm bảo các quy trình phải được thực hiện đúng, chính xác và đầy đủ.
• Người thực hiện quy trình này có nghĩa vụ phải đọc, hiểu và ký tên vào tài liệu đào tạo thực hiện quy trình này.
• Thực hiện chính xác các quy định và quy trình về việc xử lý tràn đổ theo Sổ tay an toàn, mã số VNCV5.2-STAT và văn bản VMEC.III.4.3.1.2.11.003/V0 của Bệnh viện Vinmec.

6. Quy trình kỹ thuật thực hiện xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

6.1. Loại mẫu

• Mẫu xét nghiệm là mẫu huyết tương, huyết thanh.
• Mẫu cần được tách ngay sau khi thu thập để tránh hiện tượng tan huyết vào huyết thanh
• Thu thập mẫu huyết thanh, sử dụng ống phân tách huyết thanh. Mẫu sau khi thu thập để yên 30 phút để tạo cục máu đông, sau đó ly tâm 1000×g trong 10 phút. Huyết thanh được chia ra các ống và bảo quản ở -20 độ C để tránh rã đông nhiều lần.
• Thu thập mẫu huyết tương, sử dụng ống chống đông K2-EDTA để thu thập máu. Ly tâm ống máu ở 1000×g trong thời gian 10 phút trong vòng 30 phút sau khi thu thập. Chia mẫu huyết tương vào các ống và bảo quản ở -20 độ C để tránh rã đông nhiều lần.

6.2. Tiếp nhận mẫu 

Nhân viên được phân công chuyển mẫu đến khu vực bàn giao mẫu của phòng xét nghiệm. Nhân viên tiếp nhận kiểm tra mẫu và các thông tin liên quan đến mẫu, nếu đạt yêu cầu, điền đầy đủ thông tin vào sổ bàn giao mẫu xét nghiệm “VNCV5.4-QL01BM03_3.18”. Nếu không đạt, yêu cầu lấy lại mẫu (nếu cần), hoặc bổ sung thêm thông tin của mẫu.

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

• Kiểm tra chức năng hoạt động của máy đo elisa.
• Cho hóa chất, mẫu xét nghiệm về nhiệt độ phòng trước khi thực hiện
• Chuẩn bị đầy đủ các vật tư theo danh sách
• Pha loãng RBD-HRP: 10ul RBD-HRP và 10 mL HRP dilution buffer vào ống ly tâm 15ml, bọc giấy bạc để tránh ánh sáng.
• Chuẩn bị Diluted Nab: Vontex và spin ống Nab chuẩn, hút 6ul stock cho vào 994ul Sample Dilution Buffer. Chia nhỏ 30ul Diluted Stock of NAb lưu ở -20 độ C
• Pha loãng 1× Wash Solution: theo tỷ lệ 1:20. For example, dilute 40mLs of 20X Wash Solution với 760 mLs nước cất hoặc nước đề inon và lưu ở 2°C – 8°C.
• Chuẩn bị sơ đồ mẫu theo đĩa 96 giếng BM02_Quy trình xét nghiệm SVNTs
• Chuẩn bị phiếu thực hiện xét nghiệm BM01_Quy trình xét nghiệm SVNTs

Phòng xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2 luôn luôn trong tình trạng vô khuẩn

6.4. Các bước tiến hành xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

• Hút 63μL Sample Dilution Buffer cho vào các giếng ở các cột thứ 3 của đĩa 96 giếng
• Bổ sung 7μL mẫu xét nghiệm, mẫu chứng dương/âm vào các giếng đã có Sample Dilution Buffer theo đúng sơ đồ mẫu.
• Ghi nhãn các ống ly tâm 2ml theo thứ tự 1B=> 1H, Hút 150ul Sample Dilution Buffer cho vào 1B=>1H
• Lấy ống kháng thể chuẩn Nab và ghi nhãn thành 1 A, và bổ sung 270ul Sample Dilution Buffer 
• Vontex và spin ống 1A, hút 150 ul từ 1 A sang 1 B. Vontex và Spin hút 150ul từ 1 B sang 1C. Thực hiện cho đến 1G
• Hút 70ul từ 1A đến 1H bổ sung vào các giếng từ A đến H theo sơ đồ mẫu trên đĩa elisa

Bước 2: Ủ mẫu với phức hợp RBD-HRP

• Bổ sung 70 ul diluted RBD-HRP Solution vào các cột 1 và 2 từ A đến G. Đảo đều bằng pipet
• Ủ ở 37 độ C trong 30 phút

Bước 3: Phản ứng với kháng nguyên hACE2

• Hút 100ul từ đĩa elisa lên đĩa đã phản ứng theo đúng thứ tự
• Ủ 37°C trong 15 phút
• Đổ dung dịch phản ứng, thấm khô bằng khăn giấy
• Rửa đĩa 4 với 260µL 1× Wash Solution. Dùng giấy thấm, thấm dịch còn dư trên đĩa
• Bổ sung 100µL TMB Solution vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong tối trong thời gian 15 phút
• Bổ sung 50µL of Stop Solution vào mỗi giếng

Bước 4: Đọc kết quả xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

• Bật máy đọc Elisa, khởi động phần mềm
• Cho đĩa vào máy theo đúng thứ tự, và đọc đĩa ở bước sóng 450nm
• Xuất kết quả dưới dạng Excel, file có đôi SDA.

Bước 5: Phân tích kết quả xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

• Điều kiện phân tích kết quả:
• OD450 mẫu chứng dương < 0.3
• OD450 mẫu chứng âm phải > 1.0
• Tính tỷ lệ phần trăm ức chế theo công thức

Tỷ lệ ức chế (%) = 1 – Giá trị  OD của mẫu / Giá trị OD của chứng âm x 100

• Phiên giải kết quả định tính
• Nếu tỉ lệ % ức chế ≥30%: Kết luận mẫu dương tính, có phát hiện kháng thể trung hòa trong mẫu xét nghiệm
• Nếu tỉ lệ % ức chế <30%: Kết luận mẫu âm tính, không phát hiện kháng thể trung hòa trong mẫu xét nghiệm
• Phiên giải kết quả định lượng
• Căn cứ vào OD của mẫu chuẩn, xây dựng đường chuẩn và công thức tương quan giữa giá trị OD và nồng độ kháng thể trung hòa
• Dựa vào giá trị OD của mẫu và phương trình đường chuẩn, tính nồng độ kháng thể trung hòa có trong mẫu
• Quy đổi ra giá trị IU/ml theo WHO bằng cách nhân giá trị thu được với 12.3
• Điền kết quả xét nghiệm vào biểu mẫu VNCV5.5-XNTBG07 BM01

Bước 6: Hoàn thiện hồ sơ và trả kết quả

• Hoàn thiện thông tin trong Sổ theo dõi dịch vụ xét nghiệm, mã số VNCV5.4-QL01BM01
• Nhập thông tin kết quả xét nghiệm vào phần mềm quản lý thông tin hoặc biểu mẫu Phiếu trả kết quả xét nghiệm, mã số VNCV5.9-QL01BM02.

7. Kiểm soát chất lượng xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

7.1. Kiểm soát chất lượng mẫu

• Mẫu cần được đưa đến nhóm QC trong vòng 30 phút sau khi thu thập
• Thể tích mẫu tối thiểu cần phải đạt 3ml.

7.2. Kiểm soát chất lượng thiết bị

• Các thông số trong máy cần nằm trong ngưỡng

7.3. Kiểm soát chất lượng hóa chất sử dụng

• Hóa chất sử dụng cần phải đảm bảo còn hạn sử dụng, được bảo quản đúng điều kiện.

7.4. Kiểm soát quy trình xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2

• Mẫu chứng âm, chứng dương, blank

8.Xử lý mẫu và chất thải

• Tuân thủ quy trình xử lý chất thải.
• Tiến hành vệ sinh các thiết bị và bề mặt xét nghiệm bằng cồn 70° sau khi hoàn thành xét nghiệm định lượng kháng thể trung hòa virus SARS CoV 2.

9. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

• VNCV5.5-XNTBG07BM01: Phiếu thực hiện xét nghiệm Mycoplasma bằng Mycofluor
• VNCV5.4-QL01BM01: Sổ theo dõi dịch vụ xét nghiệm.
• VNCV5.9-QL01BM03: Phiếu trả kết quả xét nghiệm
• VNCV5.3-QL01BM04: Nhật ký sử dụng thiết bị

Tài liệu tham khảo/Tài liệu liên quan

• cPass SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit Version 7.0, GenScript

Từ viết tắt:

• PID: Patient Identity
• Nab: Neutralizing Antibody

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản.

Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.

Đường link liên kết

VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0