Hướng dẫn thực hiện quy trình đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch

5. Quy trình kỹ thuật thực hiện

5.1. Loại mẫu

• Mẫu máu ngoại vi được bảo quản ở 15 – 25 độ C bằng ống chống đông Sodium Heparin trong vòng 4 giờ tại thời điểm sau khi thu thập.
• Tế bào NK và tế bào Lympho T nuôi cấy được bảo quản ở 15 – 25 độ C trong vòng 4 giờ tại thời điểm sau khi thu thập.

5.2. Tiếp nhận mẫu

• Mẫu nhận phải đảm bảo được các tiêu chuẩn trong “Phiếu nhận mẫu đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch”.
• Phiếu chỉ định dịch vụ: “Đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch”.
• Ống chứa mẫu được dán PID.

5.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình

• Ống 1: 4×10^ 6 tế bào/ml (Tương ứng với tỉ lệ E/T = 40)
• Ống 2: 2×10^6 tế bào/ml (Tương ứng với tỉ lệ E/T = 20)
• Ống 3: 1×10^6 tế bào/ml (Tương ứng với tỉ lệ E/T = 10)
• Ống 4: 0,5×10^6 tế bào/ml (Tương ứng với tỉ lệ E/T = 5)
• Kiểm tra tình trạng hoạt động của các thiết bị sử dụng trong quy trình như mục 4.1.
• Chuẩn bị hóa chất, vật tư trong quy trình đầy đủ như mục 4.2 và 4.3.

5.4. Các bước tiến hành

• Chuẩn bị môi trường nuôi cấy RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS về thể tích.
• Nhuộm tế bào đích K562 (Target cell – T) với Calcein-AM.
  • Chuẩn bị 2,5×10^6 tế bào K562 trong 2,5ml môi trường nuôi cấy trong ống ly tâm 50ml.
  • Bổ sung Calcein-AM với mật độ 10μg/ml vào ống tế bào và ủ tại 37 độ C với 5% CO2 trong 30 phút.
  • Bổ sung PBS 1X tới 15ml vào ống ly tâm, trộn đều và ly tâm với tốc độ 270xg trong 8 phút ở nhiệt độ 20 độ C. Thực hiện 2 lần.
  • Hòa tan khối tế bào thu được trong môi trường nuôi cấy với mật độ 0,2×10^6 tế bào/ml.
• Chuẩn bị tế bào đơn nhân máu ngoại vi và tế bào nuôi cấy (tế bào NK và tế bào Lympho T) (Effector cell – E)
  • Mẫu máu ngoại vi:
    • Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi bằng phương pháp ly tâm theo tỉ trọng với Ficoll.
    • Rửa tế bào đơn nhân bằng PBS 1X 2 lần, theo tốc độ ly tâm lần lượt là 640xg trong 8 phút và 270xg trong 8 phút ở nhiệt độ 20 độ C.
    • Hòa tan khối tế bào thu được trong môi trường nuôi cấy với mật độ 4×10^6 tế bào/ml.
    • Chuẩn bị tế bào đơn nhân trong ống eppendoft theo 4 nồng độ khác nhau như sau: Chuẩn bị ống tế bào (ống 1) có mật độ 4×10^6 tế bào/ml và 3 ống mới (ống 2, ống 3, ống 4) chứa 500μl môi trường nuôi cấy; Lần lượt chuyển 500 μl dung dịch ống 1 sang ống 2, trộn đều; 500 μl dung dịch ống 2 sang ống 3, trộn đều; 500 μl dung dịch ống 3 sang ống 4, trộn đều; Mật độ trong các ống tế bào đơn nhân như sau:
  • Mẫu tế bào nuôi cấy:
    • Xác định số lượng tế bào bằng thuốc nhuộm Trypan Blue
    • Ly tâm thu tế bào với tốc độ 270xg trong 8 phút ở nhiệt độ 20 độ C
    • Loại bỏ dịch nổi sau ly tâm
    • Hòa tan khối tế bào thu được trong môi trường nuôi cấy với mật độ 4×10^6 tế bào/ml.
    • Chuẩn bị các ống tế bào NK và tế bào Lympho T nuôi cấy theo 4 nồng độ khác nhau tương tự như bước chuẩn bị tế bào đơn nhân.
• Chuẩn bị mẫu đối chứng: tế bào KHYG:
  • Xác định số lượng tế bào bằng thuốc nhuộm Trypan Blue
  • Ly tâm thu tế bào với tốc độ 270xg trong 8 phút ở nhiệt độ 20 độ C
  • Loại bỏ dịch nổi sau ly tâm
  • Hòa tan khối tế bào thu được trong môi trường nuôi cấy với mật độ 4×10^6 tế bào/ml.
  • Chuẩn bị tế bào KHYG trong môi trường nuôi cấy theo 4 nồng độ khác nhau tương tự như bước chuẩn bị tế bào đơn nhân.
• Thiết kế thí nghiệm trên đĩa nuôi cấy 96 giếng half area.

Hình 1: Vị trí các mẫu tế bào trên đĩa 96 giếng half area

• Chú thích:
  • PC = mẫu đối chứng dương: tế bào K562 + môi trường nuôi cấy + DCN 90
  • C = mẫu đối chứng: môi trường nuôi cấy
  • NC = mẫu đối chứng âm: tế bào K562 + môi trường nuôi cấy
  • KHYG = tế bào KHYG đồng nuôi cấy với tế bào K562
  • E = tế bào đơn nhân máu ngoại vi/tế bào nuôi cấy đồng nuôi cấy với tế bào K562
• Bổ sung 150μl môi trường nuôi cấy vào 3 giếng C, 100μl vào các giếng NC và PC.
• Sử dụng pipet đa kênh bổ sung 50μl dung dịch tế bào K562 vào các giếng PC, NC, KHYG và E.
• Tương tự sử dụng pipet đa kênh bổ sung 100μl dung dịch tế bào KHYG và các tế bào Effector tại các nồng độ khác nhau theo như hình 1.
• Trộn đều tất cả các giếng chứa tế bào.
• Đo mẫu thời điểm 0 giờ:
• • Ly tâm đĩa tế bào với tốc độ 50xg trong 2 phút ở nhiệt độ 20 độ C.
  • Đo tín hiệu huỳnh quang đĩa thí nghiệm bằng hệ thống đánh giá hoạt tính tế bào Terascan, ghi nhận thời điểm 0 giờ.
  • Loại bỏ 40μl dung dịch tại 3 giếng PC và bổ sung ngược trở lại 40μl dung dịch DCN 90, trộn đều.
  • Ủ đĩa tế bào tại 37 độ C với 5% CO2 trong tối, 4 giờ.
• Đo mẫu thời điểm 4 giờ:
  • Sau 4 giờ, ly tâm đĩa tế bào với tốc độ 50xg trong 2 phút ở nhiệt độ 20 độ C
  • Loại bỏ 80μl dung dịch tại tất cả các giếng (trừ 3 giếng PC) và bổ sung ngược trở lại 80μl môi trường nuôi cấy, trộn đều.
  • Ly tâm đĩa tế bào với tốc độ 50xg trong 2 phút ở nhiệt độ 20 độ C.
  • Đo tín hiệu huỳnh quang đĩa thí nghiệm bằng hệ thống đánh giá hoạt tính tế bào Terascan, ghi nhận thời điểm 4 giờ.
• Phân tích kết quả:
  • Kết quả thể hiện dạng biểu đồ là tỉ lệ phần trăm (%) hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư ở các nồng độ khác nhau.

6. Kiểm soát chất lượng

• Chất lượng tế bào K562 và KHYG được kiểm soát chất lượng bởi các xét nghiệm sau:
  • Tỉ lệ sống của tế bào.
  • Tốc độ tăng sinh tế bào.
  • Hoạt tính tiêu diệt tế bào K562 của tế bào KHYG.
• Nhận định kết quả:
  • Tỉ lệ sống tế bào đạt > 80%.
  • Tốc độ tăng sinh của tế bào > 1,5 lần sau 2 ngày nuôi cấy.
  • Tỉ lệ tiêu diệt tế bào K562 của tế bào KHYG đạt > 80% tại tỉ lệ E/T=20.

7. Xử lý mẫu và chất thải

• Tuân thủ các quy định về xử lý chất thải y tế được quy định trong thông tư liên tịch số 58/2015/TT-BYT-BTNMT và Quy trình thực hiện phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ và xử lý chất thải rắn y tế, mã số 01418 của Bệnh viện Vinmec và Quy định quản lý chất thải y tế, mã số 01409/JCI-PCI 7.2 7.3 của bệnh viện Vinmec.
• Mẫu máu ngoại vi được bảo quản ở 15 độ C đến 25 độ C trong thời gian chờ xử lý tế bào.

8. Biểu mẫu/ bảng kiểm/ phụ lục

• Lưu đồ quy trình đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch.
• Danh mục hóa chất, thuốc và vật tư tiêu hao sử dụng trong quy trình.
• Danh mục các bước thực hiện trong quy trình đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch.
• Phiếu nhận mẫu thực hiện dịch vụ đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch.
• Phiếu kết quả đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch.

Từ viết tắt:

• C: Control
• Calcein-AM: Calcein-Acetyoxymethyl
• E: Effector cell
• NC: Negative control
• PC: Positive control
• T: Target cell

Phụ lục 1. Lưu đồ quy trình đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch

Phụ lục 2. Danh mục hóa chất, thuốc và vật tư tiêu hao sử dụng trong quy trình Phụ lục 3. Danh mục các bước thực hiện trong quy trình đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch Phụ lục 4. Phiếu nhận mẫu thực hiện dịch vụ đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch Phụ lục 5. Phiếu kết quả đánh giá hoạt tính tế bào miễn dịch Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0