Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch

• Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
• Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
• Ngày phát hành lần đầu: 14/09/2021                              

1. Mục đích xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch

• Hướng dẫn nhân viên nhóm kiểm tra chất lượng sản phẩm (gọi tắt là QC), Trung tâm Công nghệ cao Vinmec thực hiện xét nghiệm xác định tỉ lệ của các loại tế bào miễn dịch có trong mẫu bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy (Flow cytometry) nhằm đảm bảo độ chính xác, tin cậy của kết quả xét nghiệm và an toàn cho người thực hiện.

2. Nguyên lý

• Nguyên lý của xét nghiệm này dựa trên khả năng kết hợp của kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên biểu hiện trên bề mặt tế bào. Quy trình này sử dụng các kháng thể đơn dòng CD3, CD4, CD8, CD56 gắn các màu huỳnh quang tương ứng để định danh các loại tế bào miễn dịch và xác định tỉ lệ các loại tế bào này.
• Dựa vào các marker bề mặt tế bào để xác định tỉ lệ/số lượng các loại tế bào có trong mẫu xét nghiệm:
  • Các tế bào NK – Natural Killer cell có kiểu hình CD3-CD56+
  • Các tế bào CTL- Cytotoxic T Lymphocyte có kiểu hình CD3+CD8+
  • Các tế bào TH- Helper T cell có kiểu hình CD3+CD4+

3. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

4. Thiết bị/ vật tư tiêu hao/ hóa chất

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất

5. An toàn

• Tuân thủ các hướng dẫn an toàn trong phòng thí nghiệm được quy định trong sổ tay an toàn, mã số VNCV5.2-STAT của Trung tâm Công nghệ cao Vinmec và quy định an toàn sinh học trong Nghị định 103/2016/NĐ-CP.
• Tuân thủ các quy định về xử lý chất thải y tế được quy định trong thông tư liên tịch số 58/2015/TT-BYT-BTNMT và quy trình thực hiện phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ và xử lý chất thải rắn y tế, mã số 01418 của bệnh viện Vinmec.
• Tuân thủ quy trình xử lý tràn đổ theo văn bản VMEC.III.4.3.1.2.11.003/V0 của bệnh viện Vinmec.
• Nhân viên thực hiện điều chế huyết tương giàu tiểu cầu cần được đào tạo về quy trình này trước khi thực hiện độc lập.

6. Quy trình kỹ thuật thực hiện xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch

6.1. Loại mẫu

• Mẫu máu ngoại vi.
• Mẫu tế bào miễn dịch nuôi cấy (tế bào αBT, tế bào NK).

6.2. Tiếp nhận mẫu

• Người thực hiện tiếp nhận mẫu xét nghiệm, đối chiếu với tiêu chuẩn chấp nhận mẫu và điền thông tin vào Sổ giao nhận mẫu xét nghiệm. Tiêu chuẩn chấp nhận mẫu cho xét nghiệm này bao gồm:
  • Ống chứa mẫu được dán PID/ SID, có đầy đủ thông tin về mẫu bao gồm: loại mẫu, mật độ tế bào (đối với tế bào nuôi cấy).
• Thể tích/lượng mẫu:
  • Đối với mẫu máu ngoại vi: tối thiểu 500µl
  • Đối với mẫu tế bào nuôi cấy: tối thiểu 5×10^6 tế bào. Trường hợp lượng tế bào nuôi cấy ít, mẫu tối thiểu chứa 2×10^6 tế bào.
  • Điền đầy đủ thông tin về yêu cầu xét nghiệm, thời gian lấy mẫu, thời gian gửi mẫu,… vào sổ bàn giao mẫu xét nghiệm.
  • Ống đựng mẫu còn nguyên vẹn, không bị rò rỉ.

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch

• Kiểm tra tình trạng hoạt động của máy Flow Cytometry theo hướng dẫn sử dụng máy phân tích tế bào dòng chảy tự động Navios, Beckman Coulter.
• Chuẩn bị hóa chất, vật tư cần thiết theo danh mục nêu trên

6.4. Các bước tiến hành xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch

Bước 1: Chuẩn bị tế bào

• Đối với mẫu máu ngoại vi: vortex mẫu.
• Đối với mẫu tế bào nuôi cấy:
  • Kiểm tra thông tin mật độ tế bào và chuẩn bị ống tế bào chứa 3×10^6 tế bào.
  • Ly tâm 300 rcf trong 5 phút.
  • Giữ lại tế bào ở đáy ống, loại bỏ dịch nổi.
  • Hoàn nguyên tế bào trong 200µl dung dịch PBS 1X.

Bước 2: Chuẩn bị ống kháng thể với lượng 1 test bao gồm:

• Lưu ý: Nếu lượng mẫu ít, có thể giảm lượng kháng thể tỉ lệ với lượng tế bào cho 1 test.
• Dán PID/ SID của bệnh nhân lên ống đã có kháng thể và phiếu thực hiện xét nghiệm theo biểu mẫu VNCV5.5- XNTBG05BM01, sổ theo dõi dịch vụ xét nghiệm theo biểu mẫu VNC V5.4-QL01BM01

Bước 3: Nhuộm mẫu với kháng thể

• Đối với mẫu máu: Bổ sung 100 µl mẫu máu vào các ống kháng thể đã dán nhãn.
• Đối với mẫu tế bào nuôi cấy: bổ sung 1×10^6 tế bào vào các ống kháng thể đã dán nhãn.
• Vortex ống chứa hỗn hợp mẫu xét nghiệm và kháng thể trong thời gian 5 giây.
• Ủ các tube ở nhiệt độ phòng (18 – 25 độ C) trong 20 phút, tránh ánh sáng.

Bước 4: Ly giải hồng cầu

• Đối với mẫu máu: Bổ sung 2ml dung dịch ly giải hồng cầu (lysing solution 1X), vortex đều và ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
• Đối với mẫu tế bào nuôi cấy:
  • Thêm 1ml dung dịch PBS 1X vào mỗi tube, mix đều.
  • Ly tâm 500 rcf/3 phút hoặc 300 rcf/5 phút.
  • Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào∙ Hoàn nguyên tế bào trong 500 µl dung dịch PBS 1X.

Bước 5: Chạy mẫu trên máy Flow Cytometry

• Mở phần mềm Navios.
• Chọn protocol chạy mẫu tương ứng với mẫu máu ngoại vi hoặc mẫu tế bào nuôi cấy.
• Điền đầy đủ thông tin về mẫu trên máy:
  • Carousel Number: Số khay đựng mẫu.
  • Location Number: Vị trí các ống trên khay.
  • Sample ID1: PID – Tên bệnh nhân.
  • Sample ID2: Tên ống: Unstain/Isotype/Cocktail.
• Đặt các ống vào đúng vị trí đã cài đặt.
• Chỉnh sửa các vùng gate quần thể tế bào cho phù hợp.

Bước 6: Phân tích và ghi nhận kết quả

• Kết quả ghi nhận bao gồm:
  • Tỉ lệ % Lympho T CD3+.
  • Tỉ lệ % Lympho T CD3+/CD4+.
  • Tỉ lệ % Lympho T CD3+/CD8+.
  • Tỉ lệ % NK CD3-/CD56+.
• Hoàn thiện thông tin trong Phiếu thực hiện xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch (biểu mẫu số 01)
• Ghi nhận kết quả vào biểu mẫu Phiếu kết quả xét nghiệm.

7. Kiểm soát chất lượng

8. Xử lý mẫu và chất thải

• Mẫu còn lại sau khi thực hiện xét nghiệm được bảo quản ở 2 – 8 độ C trong vòng 48h.
• Tuân thủ quy trình xử lý rác thải.
• Tiến hành vệ sinh bề mặt các thiết bị bằng cồn 70 độ. 

9. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

• Sổ theo dõi dịch vụ xét nghiệm VNC V5.4-QG01BM01.
• Phiếu thực hiện xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch.

10. Tài liệu tham khảo/ Tài liệu liên quan

• Nghị định 103/2016/NĐ-CP.
• Thông tư liên tịch số 58/2015/TT-BYT- BTNMT.
• Sổ tay an toàn, mã số VNCV5.2-STAT.
• Quy trình thực hiện phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ và xử lý chất thải rắn y tế, mã số 01418 của bệnh viện Vinmec. Hướng dẫn xử lý tràn đổ VMEC.III.4.3.1.2.11.003/V0.
• Flow cytomery protocol, 2nd edition, 2004. T. S. Hawley and R. G. Hawley. Humana Press Inc
• Tài liệu hướng dẫn sử dụng bộ hóa chất (Consumable IFU/CIS/Setting Sheet, Beckman Coulter)
• Hướng dẫn sử dụng máy phân tích tế bào dòng chảy Navios, Beckman Coulter

Từ viết tắt:

• CD: Cluster of Differentiation
• NK: Tế bào diệt tự nhiên – Natural Killer cell
• CTL: Tế bào T độc – Cytotoxic T lymphocyte
• TH: Tế bào T hỗ trợ – Helper T cell
• PBS: Phosphate Buffer Saline
• PID: Mã số bệnh nhân

Phụ lục 1

Biểu mẫu 01. Phiếu thực hiện xét nghiệm xác định tỉ lệ tế bào miễn dịch

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản.

Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.

Đường link liên kết

VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0