Người thẩm định: Hội đồng khoa học Trung tâm Công nghệ cao 
Người phê duyệt: Giám đốc Trung tâm Công nghệ cao 
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

•  Hướng dẫn cho nhân viên khối Di truyền y học thực hiện kỹ thuật xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng  

• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện.

2. Nguyên lý  

• Kỹ thuật này dựa trên phương pháp đo mức độ phân mảnh nhiễm sắc thể tinh trùng của Fernandez và cộng sự [Fernández JL et al (2003)] 
• Mẫu tinh dịch được hòa loãng trong gel agarose trước khi trải lên lam kính đã xử lý  
• Dung dịch axit được thêm vào để làm biến tính DNA bên trong các tế bào tinh trùng  
• Sau đó, lam kính được ngâm trong dung dịch ly giải tế bào, loại bỏ hầu hết các protein trong nhân tế bào.  
• Nếu DNA tinh trùng không có những đứt gãy lớn, sẽ bung ra tạo thành đầu halo bao xung quanh đầu tinh trùng. Ngược lại, nếu chất nhiễm sắc bên trong tinh trùng có những đứt gãy sẽ không tạo thành đầu halo hoặc đầu halo với kích thước nhỏ. 

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan  

•  Halo: Vòng sáng bao xung quanh đầu tinh trùng (DNA tinh trùng được nhuộm màu) 

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/ Hóa chất thực hiện quy trình chuyên môn xét nghiệm xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất 

Số lượng trên được tính cho 1 test xét nghiệm 

5. An toàn  

•  Nhân viên thực hiện mang trang bị bảo hộ khi làm việc theo SOP-VNC-59.  
• Tuân thủ theo đúng các hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm  
• Tuân thủ đúng hướng dẫn của quy trình này  
• Xử lý rác thải theo SOP-VNC-62 

6. Quy trình thực hiện quy trình chuyên môn xét nghiệm xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

6.1. Loại mẫu  

• Mẫu tinh dịch sau khi lấy được bảo quản trong tủ 37oC cho đến khi thực hiện xét nghiệm hoặc rã đông sau khi bảo quản đông.

6.2. Tiếp nhận mẫu  

•  Mẫu tinh dịch đã đếm mật độ tinh trùng được tiếp nhận theo quy trình phối hợp nhận mẫu với Trung tâm IVF

6.3. Trước mỗi giai đoạn của quy trình xét nghiệm  

•  Bật máy ủ nhiệt và cài đặt ở nhiệt độ 37𝇈C  
• Bật máy khuấy từ, bật chức năng gia nhiệt  
• Chuẩn bị dung dịch Ethanol 90% và 70%  
  • 10ml Ethanol 90% = 9ml Ethanol 100% + 1ml nước cất hai lần  
  • 10ml Ethanol 70% = 7ml Ethanol 100% + 3ml nước cất hai lần  

• Chuẩn bị dung dịch PBS 1X:  
  • 10ml PBS 1X = 1ml PBS 10X + 9ml nước cất hai lần  

• Chuẩn bị dung dịch Giemsa gốc (phòng thu hoạch tế bào 4191):  
  • Dung dịch Giemsa lấy từ bình chứa gốc cần được ly tâm để loại kết tủa.  
  • Lấy 10ml dung dịch gốc trong ống falcon 15ml  
  • Ly tâm trên máy Allegra X15R với điều kiện 1800 vòng trong 5 phút  
  • Dùng pipet pasteur hút phần dịch nổi sang ống falcon 15ml mới.

6.4. Pha loãng mẫu tinh dịch 

• Mẫu tinh dịch được pha loãng bằng dung dịch PBS 1X để đạt đến mật độ 20 triệu tinh trùng/ml. Mật độ tinh trùng đã được xác định bởi khoa IVF khi lấy mẫu.  
• Pha loãng mẫu: bằng dung dịch PBS 1X theo tỷ lệ đã xác định trong biểu mẫu (BM01:XNG43)

6.5. Ủ gel agarose

• Chuẩn bị chai duran 500ml sạch, lấy đầy ¾ chai bằng nước cất hai lần và cho cục khuấy từ vào (khuấy từ có tác dụng làm nhiệt độ trong chai nước phân bố đều)  
• Làm nóng chai nước trong lò vi sóng đến khi nước sôi.  
• Cẩn thận lấy chai nước ra và đặt trên máy khuấy từ đã bật chức năng gia nhiệt.  
• Lấy số lượng tube gel agarose (100ml), số lượng tube eppendorf (1.5ml) tương ứng với số mẫu cần xét nghiệm. Đánh dấu mã số mẫu theo biểu mẫu xét nghiệm (BM01:XNG43).  
• Dùng dây nhựa (bên trong hộp kit) quấn chặt các tube agarose và đặt vào trong chai nước nóng đã chuẩn bị trong 5 phút.  
  • Lưu ý: Phần agarose trong các tube cần ngập trong dung dịch nước nóng để đảm bảo agarose tan đều  

• Sau khi kết thúc 5 phút, chuyển ngay các tube agarose sang bể ổn nhiệt ở 37𝇈C trong 5 phút

6.6. Cố định tinh trùng trên lam kính  

• Lấy số lượng lam kính tương ứng với số mẫu, dán mã xét nghiệm vào vị trí dán mã trên lam kính.  
• Sau 5 phút lấy các tube agarose ra và đặt trên giá, chuyển 25µl tinh dịch đã pha loãng vào các tube agarose tương ứng. Trộn đều bằng pipet  
• Lấy 15µl dung dịch hỗn hợp tra vào chính giữa vòng tròn S trên lam kính. Nhanh chóng lấy lamen, nhẹ nhàng đặt lên giọt mẫu và hơi ấn nhẹ để hỗn hợp tràn đều dưới lamen.  
• Làm tương tự với vòng tròn C còn lại trên lam kính. Lặp lại quy trình với các mẫu còn lại 
• Nhanh chóng đưa các lam kính đã phủ mẫu vào trong tủ lạnh 4oC trong 5 phút

6.7. Nhuộm DNA tinh trùng

• Chuẩn bị dung dịch biến tính (DA): lấy 16µl dung dịch biến tính pha trong 2ml nước thương mại không chứa nuclease (chỉ dùng một lần cho mỗi lần thực hiện xét nghiệm).  
• Sau khi hết 5 phút, lấy lam kính ra khỏi tủ lạnh. Nhẹ nhàng đẩy lamen ra khỏi lam kính. Đặt lam kính nên bề mặt bằng phẳng.  
• Dùng pipet 1000 lấy dung dịch biến tính đã pha loãng và nhỏ đều lên bề mặt lam kính, bao phủ phần gel agarose. Ủ trong 7 phút  
• Hết 7 phút, loại bỏ dung dịch bằng cách nghiêng lam kính trên giấy thấm. Đặt lại lam kính trên bề mặt phẳng. Dùng pipet 1000 lấy dung dịch lysis (trong bộ kit) và nhỏ đều lên bề mặt lam kính, bao phủ phần gel agarose. Ủ trong 25 phút.  
• Loại bỏ dung dịch bằng cách nghiêng lam kính trên giấy thấm. Đặt lại lam kính trên bề mặt phẳng. Dùng pipet 1000 lấy dung dịch nước thương mại (không chứa nuclease) và nhỏ đều lên bề mặt lam kính, bao phủ phần gel agarose. Ủ trong 5 phút.
•  Loại bỏ dung dịch bằng cách nghiêng lam kính trên giấy thấm. Đặt lại lam kính trên bề mặt phẳng. Dùng pipet 1000 lấy dung dịch ethanol 70% và nhỏ đều lên bề mặt lam kính, bao phủ phần gel agarose. Ủ trong 2 phút.  
• Làm tương tự với ethanol 90% và 100%.  
• Để lam kính khô tự nhiên. Sau bước này, nếu chưa tiến hành nhuộm có thể bảo quản lam kính trong khu vực tối trong nhiều tháng.  
• Chuẩn bị dung dịch nhuộm (Giemsa): dung dịch Giemsa pha trong nước thương mại (không chứa nuclease) với tỷ lệ 1:1.  
• Dùng pipet 1000 lấy dung dịch nhuộm và nhỏ đều lên bề mặt lam kính, bao phủ phần gel agarose. Ủ trong 10 phút.  
• Loại bỏ dung dịch bằng cách nghiêng lam kính trên giấy thấm. Để khô tự nhiên trước khi đọc trên kính hiển vi.

6.8.  Đọc kết quả trên kính hiển vi  

• Đọc kết quả trên kính hiển vi CX31 ở vật kính 40  
• Chú ý: Chọn những vi trường mà mật độ không quá cao (< 80 spz/vi trường) để tránh sai số.  
• Nhận định kết quả: 
• Tinh trùng không bất thường:  

• • • • Tinh trùng với đầu Halo lớn: (Chiều rộng của đầu Halo ≥ đường kính của đầu tinh trùng)  
      • Tinh trùng có đầu Halo trung bình: (1/3 đường kính của đầu tinh trùng < chiều rộng của đầu Halo < đường kính của đầu tinh trùng) 

• Tinh trùng bất thường:  

• • • Tinh trùng với đầu halo nhỏ: (Chiều rộng của đầu Halo < 1/3 đường kính của đầu tinh trùng)  
    • Tinh trùng không có đầu halo hoặc bị phân giải: không quan sát thấy đầu Halo và/hoặc đầu tinh trùng nhuộm màu nhạt hơn

•  Đọc ít nhất 500 tinh trùng, ghi kết quả vào biểu mẫu (BM01: XNG43)
•  Tính tỷ lệ phân mảnh tinh trùng (Sperm DNA Fragmentation): SDF (%) = Số tinh trùng bất thường/Tổng số tinh trùng 

6.9. Phân tích và báo cáo kết quả

Tỷ lệ phân mảnh tinh trùng được đánh giá qua các trường hợp sau:  

• SDF < 15%: tỷ lệ thấp  
• 15% < SDF < 30%: tỷ lệ trung bình  
• SDF > 30%: tỷ lệ cao

7. Kiểm soát chất lượng 

• Mật độ tinh trùng thấp nhất có thể thực hiện được xét nghiệm là 500.000 tinh trùng/ml  
• Kiểm tra hạn sử dụng, điều kiện bảo quản của các dung dịch, hóa chất trước khi sử dụng  
• Mẫu tinh dịch để bên ngoài trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. Yêu cầu thực hiện xét nghiệm ngay sau khi nhận mẫu

8. Xử lý mẫu và chất thải 

Không áp dụng Phụ lục 1: Biểu mẫu xét nghiệm Halosperm (BM01: XNG43)  Phụ lục 2: Phiếu trả kết quả xét nghiệm (BM02: XNG43)  Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện 

Quy trình xác định mức độ phân mảnh DNA tinh trùng

Tài liệu tham khảo 

• Halosperm package insert: http://www.halotechdna.com/wp-content/uploads/2014/10/IUhalosperm-eng.pdf  
• Fernandez, J. L., Muriel, L., Goyanes, V., Segrelles, E., Gosalvez, J., Enciso, M., Lafromboise, M. & De Jonge, C. 2005. Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test. Fertil Steril, 84, 833-42. 

Từ viết tắt

• DNA: Axit Deoxyribonucleic  
• PBS: Đệm phốt phát  
• DA: Dung dịch biến tính  
• SDF: Tỷ lệ phân mảnh tinh trùng (Sperm DNA Fragmentation) 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0