Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng y học tái tạo 
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

• Hướng dẫn cho nhân viên khối Di truyền y học thực hiện xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang (PRA) bằng bộ kit Lifecodes.  
• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện 

2. Nguyên lý  

• Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) là hệ thống các glycoprotein có vai trò trình diện các đoạn peptide cho hệ miễn dịch. Tuy vậy, dựa vào tính đa hình, các phân tử HLA có thể trở thành mục tiêu của các phản ứng sinh kháng thể trong cơ thể qua quá trình mang thai, truyền máu hoặc phản ứng thải ghép. Thông thường, quá trình alloimmunization sẽ dẫn đến sự hình thành các kháng thể kháng HLA trong khoảng 33% các cá thể đã bị phơi nhiễm. Sự xuất hiện hay vắng mặt của các kháng thể kháng HLA đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của phẫu thuật ghép tạng.  
• Các hạt Lifecodes LifeScreen Deluxe được thiết kế để phát hiện các kháng thể kháng IgG đối với HLA nhóm I và II. LifeScreen Deluxe chứa các hạt Luminex riêng biệt để hình thành liên kết với các glycoprotein HLA nhóm I và II.  
• Các hạt Lifecodes Class I ID được thiết kế để phát hiện các kháng thể kháng IgG đối với HLA nhóm I. Lifecodes Class I ID chứa các hạt Luminex riêng biệt để hình thành liên kết với các glycoprotein HLA nhóm I.  
• Các hạt Lifecodes Class II ID được thiết kế để phát hiện các kháng thể kháng IgG đối với HLA nhóm II. Lifecodes Class II ID chứa các hạt Luminex riêng biệt để hình thành liên kết với các glycoprotein HLA nhóm II.  
• Dung dịch chứa hạt bead đc ủ với một lượng nhỏ thể tích các mẫu huyết thanh. Hỗn hợp sau đó được rửa để loại bỏ các kháng thể không hình thành liên kết. Kháng thể kháng IgG người có gắng phycoerythrin được thêm vào hỗn hợp. Sau khi ủ, mẫu được pha loãng và phân tích trên hệ thống Luminex. Cường độ tín hiệu từ mỗi loại hạt bead được so sánh với cường độ tín hiệu của hạt beat chứng âm đã được đưa vào trong quá trình chuẩn bị để xác định xem liệu các hạt bead có dương tính hay âm tính trong việc gắn kết với kháng thể ngoại lai (antibody) 

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan  

• PRA: Panel Reaction Antibody 

4. Thiết bị/ vật tư tiêu hao/ Hóa chất xét nghiệm xác định kháng thể kháng HLA

4.1. Thiết bị/ Dụng cụ

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất 

5. An toàn  

• Nhân viên thực hiện mang trang bị bảo hộ khi làm việc theo SOP-VNC-59.  
• Tuân thủ theo đúng các hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm  
• Tuân thủ đúng hướng dẫn của quy trình này  Xử lý rác thải theo SOP-VNC-62 

6. Quy trình thực hiện xét nghiệm xác định kháng thể kháng HLA

6.1. Loại mẫu  

• Mẫu máu toàn phần đựng trong ống lấy máu không chống đông (ống đỏ)

6.2. Tiếp nhận mẫu  

• Mẫu tiếp nhận theo quy trình phối hợp nhận mẫu với Khoa xét nghiệm 

6.3. Trước mỗi giai đoạn của quy trình xét nghiệm  

• Chuẩn bị biểu mẫu xét nghiệm BM01-XP011  
• Kiểm tra và khởi động các thiết bị cần sử dụng.  
• Lấy các chai Wash Buffer trong các bộ kit để ở nhiệt độ phòng  
• Khử nhiễm dụng cụ, thiết bị, bề mặt, không gian làm việc bằng ethanol 70%  
• Kiểm tra và chuẩn bị đủ vật tư tiêu hao và dụng cụ cần thiết như đầu côn, pipet, giá đựng ống nghiệm, khay lạnh, bình đá vẩy  
• Khởi động máy Luminex, tiến hành các bước rửa máy 

6.4. Tách huyết thanh  

• Chuẩn bị 1 ống eppendorf 1.5ml, dán nhãn bệnh nhân (người cho, người nhận)  
• Ly tâm ống máu nắp đỏ của người cho và người nhận ở tốc độ 3000rpm trong 10 phút  
• Dùng pipet hút lớp huyết thanh ở phía trên ống máu vào ống eppendorf 1.5ml tương ứng đã dán nhãn (lưu ý: tránh hút lớp tế bào máu)  
• Mẫu huyết thanh có thể lưu trữ ở 4 – 8 ºC trong vòng 48 tiếng trước khi thực hiện xét nghiệm. Nếu không thực hiện xét nghiệm trong vòng 48 tiếng, cần phải bảo quản mẫu ở -20ºC. 

6.5. Thực hiện thao tác và phân tích Lifescreen Deluxe  

• Dùng lớp giấy bạc phủ kín bề mặt đĩa Filter Plate 96 giếng. Sau đó dùng dao cắt và mở phần giấy bạc trên mỗi giếng ứng với số mẫu (gồm cả 2 mẫu chứng âm và chứng dương).  
• Làm ẩm các giếng bằng 200 μL nước cất. Sau khi ủ 2 – 5 phút, dùng máy hút để hút toàn bộ dung dịch  
• Ly tâm ống HLA Beads trong vòng 30s ở tốc độ 600 – 800g để đưa toàn bộ dung dịch xuống đáy ống. Sau đó, lắc ống này trong 1 phút bằng máy vortex.  
• Đưa 40 μL Wash Buffer vào mỗi giếng và sau đó tra 12.5 μL mẫu huyết thanh của bệnh nhân và 2 mẫu chứng  
• Thêm 5 μL HLA Beads vào mỗi giếng (lưu ý tránh sáng)  
• Đậy nắp đĩa (có phủ giấy bạc) và tiến hành ủ lắc ở tốc độ 250 rpm, nhiệt độ phòng, trong 30 phút.  
• Pha loãng dung dịch conjugate theo tỷ lệ 5 μL conjugate và 45 μL wash buffer cho mỗi mẫu. 
• Cất dung dịch pha loãng trong tối ở nhiệt độ phòng.  Cất toàn bộ hóa chất (trừ Wash Buffer) và mẫu vào tủ mát 
• Sau khi ủ đĩa 30 phút, thêm 100 μL Wash Buffer vào mỗi giếng. Trộn đều và hút dung dịch bằng máy hút ở áp suất thấp.  
• Thêm 250 μL Wash Buffer vào mỗi giếng và hút dung dịch bằng máy hút, lặp lại ba lần.  
• Thêm 50 μL dung dịch Conjugate đã được pha loãng vào mỗi giếng.  
• Đậy nắp đĩa (có phủ giấy bạc) và tiến hành ủ lắc ở tốc độ 250 rpm, nhiệt độ phòng, trong 30 phút.  
• Sau khi ủ đỉa 30 phút, Thêm 150 μL Wash Buffer vào mỗi giếng và trộn đều.  
• Đưa đĩa vào máy Luminex, chọn chương trình chạy và vị trí các giếng cần phân tích trước khi bắt đầu hút mẫu và ghi nhận kết quả thô. 
  • Lưu ý: Chọn đúng số Lô bộ kit trên phần mềm ứng với số Lô bộ kit đã sử dụng. Nếu là bộ kit mới và chưa có thông tin trên phần mềm, cần lên trang website của hãng để tải thông tin.  

• Kết quả thô sau đó được đưa vào phần mềm Lifecodes để phân tích: 
  • Mẫu NC cần thể hiện âm tính với cả 2 phân lớp 
  • Mẫu PC cần thể hiện dương tính với cả 2 phân lớp 
  • Nếu mẫu bệnh nhân thể hiện âm tính đến cả 2 phân lớp → tiến hành trả kết quả 
  • Nếu mẫu bệnh nhân thể hiện dương tính với 1 trong 2 phân lớp hoặc cả 2  tiến hành thao tác và phân tích Class ID 

6.6. Thực hiện thao tác và phân tích Class ID 

• Thao tác cho class I và II có thể thực hiện cùng lúc, tuy nhiên chuỗi mẫu (bao gồm cả 2 mẫu chứng) là 2 chuỗi độc lập  
• Dùng dao cắt và mở phần giấy bạc trên mỗi giếng ứng với số mẫu (gồm cả 2 mẫu chứng âm và chứng dương).  
• Làm ẩm các giếng bằng 200 μL nước cất. Sau khi ủ 2 – 5 phút, dùng máy hút để hút toàn bộ dung dịch  
• Ly tâm ống HLA Beads trong vòng 30s ở tốc độ 600 – 800g để đưa toàn bộ dung dịch xuống đáy ống. Sau đó, lắc ống này trong 1 phút bằng máy vortex.  
• Đưa 40 μL Wash Buffer vào mỗi giếng và sau đó tra 12.5 μL mẫu huyết thanh của bệnh nhân và 2 mẫu chứng  
• Thêm 5 μL HLA Beads vào mỗi giếng (lưu ý tránh sáng)  
• Đậy nắp đĩa (có phủ giấy bạc) và tiến hành ủ lắc ở tốc độ 250 rpm, nhiệt độ phòng, trong 30 phút. 
• Pha loãng dung dịch conjugate theo tỷ lệ 5 μL conjugate và 45 μL wash buffer cho mỗi mẫu. Cất dung dịch pha loãng trong tối ở nhiệt độ phòng.  
• Cất toàn bộ hóa chất ( trừ Wash Buffer) và mẫu vào tủ mát  
• Sau khi ủ đĩa 30 phút, thêm 100 μL Wash Buffer vào mỗi giếng. Trộn đều và hút dung dịch bằng máy hút ở áp suất thấp.  
• Thêm 250 μL Wash Buffer vào mỗi giếng và hút dung dịch bằng máy hút, lặp lại ba lần.  
• Thêm 50 μL dung dịch Conjugate đã được pha loãng vào mỗi giếng.  
• Đậy nắp đĩa (có phủ giấy bạc) và tiến hành ủ lắc ở tốc độ 250 rpm, nhiệt độ phòng, trong 30 phút.  
• Sau khi ủ đỉa 30 phút, Thêm 150 μL Wash Buffer vào mỗi giếng và trộn đều.  
• Đưa đĩa vào máy Luminex, chọn chương trình chạy (chương trình là khác nhau giữa ID class I và ID class II) và vị trí các giếng cần phân tích trước khi bắt đầu hút mẫu và ghi nhận kết quả thô.  
• Sau khi hoàn tất việc chạy mẫu, tiền hành các bước rửa và tắt máy Luminex.  
  • Lưu ý: Chọn đúng số Lô bộ kit trên phần mềm ứng với số Lô bộ kit đã sử dụng. Nếu là bộ kit mới và chưa có thông tin trên phần mềm, cần lên trang website của hãng để tải thông tin.  

• Kết quả thô sau đó được đưa vào phần mềm Lifecodes để phân tích: 
  • Mẫu NC cần thể hiện âm tính với chỉ số PRA là 0% 
  • Mẫu PC cần thể hiện dương tính với chỉ số PRA là 100% 

6.7. Nguyên tắc phân tích ID class I và II  

• Chọn các thông số cố định đã quy định sẵn trong phần mềm Lifecodes: 
  • Assign Adjust = 0.00 
  • Assign cut-off = 2  

• Kết quả thu nhận bao gồm: 
  • %PRA nằm trong cột PRA 
  • Dãy các Anti-HLA nằm trong Tail Antigen  
• Kết quả này có độ tin tưởng cao và được sử dụng nếu % positive của các Anti-HLA là 100%  
• Nếu % positive nhỏ hơn 70%, cần thực hiện phân tích thủ công: 
  • Vào Tail Adjustment/Grouping 
  • Vào New 
  • Tiến hành chọn các Anti-HLA trong cột Remaining Antigen theo thứ tự % positive cao đến thấp, từ trên xuống 
  • Dừng lại ở các phân lớp có % positive nhỏ hơn 70% 
  • Sử dụng các phân lớp liệt kê trong Tail Antigen để báo cáo kết quả 

6.8. Báo cáo kết quả 

• Hoàn thành biểu mẫu BM01-XP011  
• In file phân tích từ phần mềm.  
• Trả kết quả xét nghiệm theo quy trình “Trả kết quả xét nghiệm” (QTKT06). 

7. Kiểm soát chất lượng  

• Bộ kit được kiểm soát chất lượng bằng: 
  • Chứng âm: mẫu huyết thanh không chứa các kháng thể kháng HLA được cung cấp kèm bộ kit 
  • Mẫu dương: mẫu huyết thanh chứa kháng thể kháng HLA (100% PRA) được cung cấp kèm bộ kit  

• Tần suất kiểm tra: kiểm tra mỗi lần thực hiện xét nghiệm 

8. Xử lý mẫu và chất thải  

• Mẫu sau khi thực hiện xét nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ -80ºC.  
• Tuân thủ quy trình xử lý chất thải y tế.  
• Tiến hành vệ sinh các thiết bị và bề mặt xét nghiệm bằng cồn 70 độ

Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi xét nghiệm BM01-XP011 Phụ lục 2: Phiếu trả kết quả xét nghiệm BM02-XP011  Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện xét nghiệm 

Quy trình miễn dịch huỳnh quang 

Từ viết tắt

• HHPƯ: Hỗn hợp phản ứng 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0