Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xét nghiệm vi nấm nhuộm soi

Người thẩm định: Đoàn Mai Phương
Người phê duyệt: Phùng Nam Lâm
Ngày phát hành: 16/05/2022

1. Mục đích

Mô tả quy trình kỹ thuật nhuộm Gram cho nhân viên Khoa Xét nghiệm về các bước tiến hành nhuộm Gram cho các bệnh phẩm tìm vi nấm trong phòng xét nghiệm.

2. Phạm vi

Quy trình này áp dụng cho mọi nhân viên Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện đa khoa Quốc tế Vinmec Times City.

3. Trách nhiệm

• Nhân viên được giao nhiệm vụ thực hiện xét nghiệm này tuân thủ đúng quy trình.
• Trưởng đơn nguyên, kỹ thuật viên trưởng đơn nguyên Vi sinh, trưởng tua trực chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ đúng quy trình.

4. Định nghĩa và từ viết tắt

• QC (Quality Control): Nội kiểm
• EQA (External Quality Assurance): Ngoại kiểm

5. Nguyên lý

Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram (+) sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode mà không bị tẩy màu bởi cồn, trong khi đó vi khuẩn Gram (-) không giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram (+) vẫn giữ được màu tím của Gentian, còn vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của Fuchsin.
Mô tả quy trình kỹ thuật xét nghiệm vi nấm nhuộm soi

6. Loại mẫu sử dụng

• Tất cả các bệnh phẩm như: phân, đờm, cặn nước tiểu, cặn các loại dịch,… và trực tiếp từ khuẩn lạc vi nấm từ môi trường nuôi cấy 18-24h, không quá 48h;
• Yêu cầu:
  • Tuân thủ cách lấy bệnh phẩm theo “Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm”.
  • Các mẫu sau khi lấy xong nên được vận chuyển ngay đến Khoa Xét nghiệm để tiến hành xét nghiệm để cho kết quả chính xác.

7. Trang thiết bị và vật tư

7.1. Thiết bị

• Tủ an toàn sinh học.
• Kính hiển vi quang học.

7.2. Vật liệu

• Dụng cụ:
  • Que cấy.
  • Bút chì kính.
  • Đèn cồn.
  • Lam kính.
  • Dầu soi.
  • Nước muối sinh lý (NaCl 0,9%).
• Hóa chất: Bộ thuốc nhuộm Gram: Bio Merieux, Pháp:
  • Dung dịch R1 Oxalate Crystal violet (tím gentian).
  • Dung dịch R2 Stabilized Lugol-PVP.
  • Dung dịch R3 Decolorizer.
  • Dung dịch R4 Safranin.
  • Các dung dịch này bảo quản ở 15-25 độ C cho đến hạn sử dụng.

8. Chuẩn bị bệnh nhân

Không áp dụng

9. Quy trình thực hiện xét nghiệm vi nấm nhuộm soi

9.1. Chuẩn bị tiêu bản

• Lấy tiêu bản hơ trên ngọn lửa đèn cồn để tan dầu.
• Ghi tên số bệnh phẩm hoặc dán barcode lên phía đầu lam.
• Các loại bệnh phẩm:
  • Bệnh phẩm phân: Nhỏ 1 giọt NaCl 0,9% lên lam kính khô và sạch. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 ít bệnh phẩm hòa đều vào giọt NaCl 0,9% nhỏ sẵn, tạo 1 vùng tròn đường kính khoảng 1 cm. Để khô tự nhiên.
  • Các bệnh phẩm mủ, đờm, dịch họng, dịch tỵ hầu, dịch phế quản, tiểu: Dàn bệnh phẩm trực tiếp lên lam kính. Để khô tự nhiên.
  • Bệnh phẩm dịch não tuỷ, các chất dịch vô trùng: lắc đều ống bệnh phẩm, dùng pipet vô trùng hút và nhỏ một giọt bệnh phẩm lên lam kính. Để khô tự nhiên.
• Khuẩn lạc vi nấm:
  • Nhỏ 1 giọt NaCl 0.9% lên lam kính khô và sạch.
  • Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa đều vào nước muối nhỏ sẵn tạo 1 vùng tròn đường kính khoảng 1cm.  Để khô tự nhiên.

9.2. Cố định

• Hơ trên ngọn lửa đèn cồn 3 lần. Mỗi lần 1 giây. Chú ý tránh hơ tiêu bản quá nóng.
• Để nguội.

9.3. Nhuộm

• Để tiêu bản lên giá.
• Phủ thuốc nhuộm tím gentian (R1) lên đầy tiêu bản và để 1 phút.
• Rửa nhẹ nhàng tiêu bản dưới vòi nước sạch.
• Phủ Lugol (R2) để khoảng 1 phút.
• Rửa tiêu bản nhẹ nhàng dưới vòi nước sạch.
• Tẩy màu nhanh bằng cồn (R3).
• Rửa ngay tiêu bản dưới vòi nước sạch.
• Phủ Fuchsin để khoảng 1 phút.
• Rửa nhẹ nhàng dưới vòi nước sạch.

9.4. Để khô tự nhiên

9.5. Soi dưới vật kính dầu (100x)

9.6. Đọc kết quả xét nghiệm vi nấm nhuộm soi

Vi nấm: bắt màu tím sẫm Crystal violet oxalate.

9.7. Lưu hủy mẫu bệnh phẩm, tiêu bản

Theo “Quy trình lưu và hủy bệnh phẩm sau xét nghiệm”

10. Kiểm tra chất lượng

10.1. Các việc cần kiểm tra trước và sau khi thực hiện quy trình

• Thuốc nhuộm: Phải đảm bảo chất lượng và hạn sử dụng.
• Quan sát lọ chứa dung dịch thuốc nhuộm hàng ngày.
  • Nếu lọ Crystal violet kết tủa hoặc lắng cặn, lọc trước khi sử dụng.
  • Thay đổi thường xuyên dung dịch nhuộm sử dụng hàng ngày để tránh không bị cạn. Thuốc nhuộm bị bốc hơi có thể làm thay đổi hiệu quả của thuốc thử.
  • Hạn chế tái sử dụng lọ chứa thuốc nhuộm bằng cách thay lọ thuốc nhuộm ít nhất hàng tháng.
  • Thuốc nhuộm có thể bị nhiễm bẩn. Khi nghi ngờ nhiễm bẩn, sử dụng mẻ thuốc nhuộm mới.

10.2. Các yêu cầu hiệu chuẩn

Hiệu chuẩn kính hiển vi theo định kỳ.

10.3. Nội kiểm tra chất lượng (QC)

10.3.1. Tần suất kiểm tra chất lượng

Kiểm tra chất lượng (QC) nhuộm Gram hàng ngày và trước khi mở một lô thuốc nhuộm mới, hoặc khi nghi ngờ chất lượng thuốc nhuộm có vấn đề.

10.3.2. Chuẩn bị tiêu bản

• Chuẩn bị 1 khuẩn lạc Escherichia coli ATCC 25922 và 1 khuẩn lạc. Staphylococcus aureus ATCC 25923 sau khi nuôi cấy qua đêm (16-18h).
• Nhỏ 1 giọt NaCl 0,9% lên lam kính.
• Dùng 1 ăng lấy khuẩn lạc Escherichia coli ATCC 25922 nghiền vào giọt NaCl 0,9%.
• Dùng 1 ăng khác lấy khuẩn lạc Staphylococcus aureus ATCC 25923 nghiền vào cùng giọt NaCl 0,9%.
• Để khô tự nhiên.
• Cố định bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần, mỗi lần 1 giây.
• Nhuộm theo các bước của mục 9.3.

10.3.3. Đánh giá tiêu bản

• Đánh giá tiêu bản:
  • Mật độ vi khuẩn vừa phải, đều.
  • Hình thể vi khuẩn rõ ràng, không bị biến dạng.
  • Vi khuẩn bắt màu đúng.
  • Độ sạch tiêu bản không có cặn bẩn, sáng, dễ xem.
  • Kích cỡ tiêu bản: khoảng 1cm2.
• Thời gian định kỳ kiểm tra chất lượng tiêu bản: hàng tuần. 10.3.4. Kết quả chấp nhận.
• Staphylococcus aureus ATCC 25923: Cầu khuẩn Gram – dương bắt màu tím. Escherichia coli ATCC 25922: Trực khuẩn Gram-âm màu hồng.

10.4. Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA)

Tham gia ngoại kiểm tại các Trung tâm kiểm chuẩn/phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn.

11. An toàn

• Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo Chương trình an toàn phòng xét nghiệm.
• Thực hiện bảo hộ cá nhân đầy đủ khi tiếp xúc với các bệnh phẩm và tránh nhiễm chéo và không lây nhiễm cho nhân viên y tế.
• Trong trường hợp đánh đổ bệnh phẩm, phải cẩn thận làm sạch nơi bị đổ cùng với chất sát khuẩn để đảm bảo an toàn sinh học.

12. Dải tuyến tính

Không áp dụng.

13. Diễn giải và báo cáo kết quả xét nghiệm vi nấm nhuộm soi

Báo cáo kết quả về hình thể, kích thước của vi nấm.
Kết quả xét nghiệm vi nấm nhuộm soi

14. Các yếu tố ảnh hưởng

14.1. Các nguồn biến thiên tiềm tàng

• Kết quả nhuộm Gram không đạt yêu cầu: Khi nhuộm Gram cho thấy bằng chứng chất lượng kém, kết quả nhuộm khó diễn giải, hoặc diễn giải không chính xác. Đặc điểm nhuộm xấu (ví dụ như vi khuẩn Gram dương bắt màu nhạt, vi khuẩn Gram âm bắt màu tím, chỉ nhuộm mép của nốt nhuộm, kết tủa trên lam, vv) có thể do chuẩn bị bệnh phẩm, thuốc nhuộm, hoặc quá trình nhuộm.
• Sau khi phủ dung dịch tím gentian, không rửa sạch màu thừa trên lam kính, sau đó phủ lugol trên tiêu bản thì màu của tím gentian thừa sẽ bị tủa lại bám trên bề mặt tiêu bản. Kết quả khi quan sát qua kính hiển vi sẽ thấy rất nhiều tinh thể tím gentian bám trên tiêu bản làm lầm tưởng hình ảnh vi nấm.

14.2. Các chú ý để đảm bảo tốt kết quả của quy trình

Tiến hành khắc phục bằng cách thiết lập một hệ thống để xem xét báo cáo kết quả nhuộm Gram:

• Nhân viên giám sát xem xét các tiêu bản nhuộm Gram để xác định nhu cầu đào tạo và để hỗ trợ lâm sàng phù hợp
• So sánh kết quả nuôi cấy cuối cùng với kết quả nhuộm Gram để kiểm tra hình thái VSV có trên tiêu bản nhuộm Gram nhưng nuôi cấy không mọc. Tương tự như vậy, xem xét tất cả các trường hợp nuôi cấy định lượng 3(+) đến 4(+) khi nuôi cấy nhưng nhuộm Gram không phát hiện được.

Lưu ý: Một số lớn các vi sinh vật quan sát được trên tiêu bản nhuộm Gram có thể nuôi cấy được. Điều tra sự khác biệt để phát hiện lỗi khi nhuộm để đánh giá hoặc chỉ định nuôi cấy thêm.

15. Lưu hồ sơ

Ghi chép rõ ràng kết quả vào hệ thống mạng Labconn.

16. Tài liệu liên quan

• Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm.
• Quy trình lưu và hủy bệnh phẩm sau xét nghiệm.
• Quy trình trả kết quả xét nghiệm.
• Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học.

17. Tài liệu tham khảo

• Bio Merieux, Color Gram 2 (COLOR GRAM 2 – F) Staining of microorganisms – package instruction, 2015 (TLBN.VS.NS.002).
• WHO, Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Second edition, 2003 (TLBN.VS.TC.001).
• Xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, 2012 (TLBN.VS.TC.002).

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0