Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng y học tái tạo 
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

•  Hướng dẫn cho chuyên viên và kỹ thuật viên phòng xét nghiệm thực hiện quy trình tổng thể cho xét nghiệm sàng lọc ung thư di truyền bao gồm: (1) Xử lý mẫu ADN; (2) Chuẩn bị thư viện sử dụng bộ sinh phẩm Trusight Cancer (Illumina) khảo sát 94 gen và 248 SNPs liên quan đến nguy cơ ung thư di truyền; (3) Giải trình tự trên hệ thống máy MiSeq (Illumina); (4) Phân tích số liệu và xây dựng phiếu kết quả.  
• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện.

2. Nguyên lý xét nghiệm sàng lọc ung thư di truyền  

Công nghệ lõi của xét nghiệm là công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới của Illumina. Về cơ bản, nguyên lý của giải trình tự thế hệ mới bằng phương pháp tổng hợp tương tự như giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger, trong đó ADN polymeraza tổng hợp chuỗi ADN hình thành bằng cách sử dụng dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi ADN đang tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung. Đối với giải trình tự thế hệ mới, thay vì giải trình tự một đoạn đơn lẻ, kỹ thuật này cho phép giải trình tự với một lượng lớn các đoạn ADN khác nhau, song song tại cùng một thời điểm, và cho lượng dữ liệu đầu ra lớn.  Quy trình cơ bản của giải trình tự gen thế hệ mới bao gồm các giai đoạn:

• Tạo thư viện: ADN cần giải trình tự được tách chiết và cắt thành các mảnh nhỏ (fragmentation) và gắn các adapter cần thiết cho quá trình giải trình tự. Đối với bộ sinh phẩm Trusight cancer sử dụng cho xét nghiệm này, phương pháp tạo thư viện là phương pháp Nextera trong đó kết hợp đồng thời việc phân mảnh ADN; lai trình tự adapter trong một phản ứng xúc tác bởi phức hợp enzyme transposase gắn các oligo adapter. Các đoạn ADN sau đó được gắn index ở hai đầu 5’ và 3’ (lần lượt là i5 và i7) nhằm mục đích phân biệt được các đoạn ADN ngắn trong hỗn hợp thư viện. Hai index i5 và i7 được gắn vào các đoạn ADN tổng hợp mới trong quá trình nhân lên bởi phản ứng PCR với trình tự mồi bổ sung với trình tự đoạn adapter đã được gắn ở bước trước đó. Sau đó, toàn bộ thư viện được khuếch đại và làm giàu bao gồm tất cả các đoạn trình tự thuộc vùng exon và intron trên toàn bộ hệ gen. Ở bước tiếp theo vùng trình tự mã hóa của 94 gen nằm trong mục tiêu của bộ chuẩn bị thư viện này được giữ lại thông qua 02 bước lai với mẫu dò đặc hiệu. Các đoạn trình tự thuộc vùng mã hóa của 94 gen đích được nhân lên bằng phương pháp PCR nhằm đạt đủ lượng cho bước giải trình tự.
• Tạo cluster: Mỗi sợi ADN được giữ lại trên bề mặt thiết bị giải trình tự (flow cell) bằng adapter đã được gắn trước đó. Mỗi sợi ADN sau khi được khuếch đại sẽ tạo thành một cụm ADN (cluster) có trình tự giống hệt nhau để sử dụng cho quá trình giải trình tự. 
• Giải trình tự: dNTP có gắn các tín hiệu huỳnh quang tương ứng với 4 loại nucleotide. Tín hiệu huỳnh quang của từng nucleotide được ghi lại trong quá trình tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung trên sợi ADN khuôn. 
• Phân tích kết quả: Kết quả từ quá trình giải trình tự được phân tích dựa trên mục đích và panel gen của xét nghiệm 

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan 

Nêu định nghĩa những thuật ngữ, khái niệm quan trọng, nếu có: 

• Nextera transposase: Là một loại enzyme có chức năng cắt không đặc hiệu trình tự ADN thành các đoạn ngắn, đồng thời có khả năng gắn một đoạn trình tự adapter ngắn tại vị trí cắt. 
• Adapter là các đoạn trình tự ngắn được gắn vào các đoạn ADN đã được cắt ngắn trong quá trình phân mảnh hệ gen bằng transposase. Vùng trình tự này là điểm đích của mồi trong quá trình gắn index. 
• Index: Là các đoạn trình tự gồm 10 nucleotide để phân biệt và định danh các đoạn ADN ngắn được tạo ra sau quá trình phân mảnh hệ gen. 
• Lai với mẫu dò đặc hiệu: Là bước để giữ lại các vùng trình tự đích quan tâm (bao gồm toàn bộ vùng exon của 94 gene và các vùng quan tâm khác).

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/Hóa chất

4.1. Thiết bị/ Dụng cụ

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất

5. An toàn

• Nhân viên thực hiện mang trang bị bảo hộ khi làm việc theo SOP-VNC-59. 
• Tuân thủ theo đúng các hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm 
• Tuân thủ đúng hướng dẫn của quy trình này 
• Xử lý rác thải theo SOP-VNC-62

6. Quy trình thực hiện 

6.1. Loại mẫu  

• Mẫu đầu vào là gADN. 

6.2. Tiếp nhận mẫu  

• Lượng thể tích gADN đầu vào tối thiểu 20 µL ở nồng độ 25 ng/µL, với độ sạch đo bằng NanoDrop A260/280 = 1.8 – 2.0  
• Để phát huy tối đa hiệu quả của bộ KIT chuẩn bị thư viện TruSight Rapid Cature, phương pháp phân mảnh ADN hệ gen bằng enzyme được khuyến cáo sử dụng. Việc xác định chính xác lượng ADN đầu vào cho bước phân mảnh này là rất quan trọng. 

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình

Quy định về định lượng mẫu gADN  

• Định lượng ADN hệ gen bằng phương pháp phổ huỳnh quang đặc hiệu cho ADN sợi kép, thực hiện việc định lượng lặp lại 3 lần. Không sử dụng các phương pháp định lượng tổng số khác như NanoDrop hoặc phương pháp đo độ hấp phụ tia UV.  
• Thực hiện quy trình 2 bước chuẩn hóa nồng độ ADN hệ gen nhằm hạn chế sự sai lệch về nồng độ trong quá trình gắn thẻ (tagmentation). Nồng độ ADN hệ gen được chuẩn hóa về 10 ng/µL ở bước thứ nhất và 5 ng/µL ở bước thứ 2.  
• Bộ KIT chuẩn bị thư viện TruSight Rapid Capture được tối ưu cho lượng ADN hệ gen đầu vào là 50 ng cho mỗi mẫu. 

Tránh nhiễm chéo  

• Thực hiện thay đầu tip mỗi khi thực hiện các thao tác như đưa mẫu vào các giếng, chuyển mẫu, bổ sung mồi hay adapter.  
• Đặt các ống chứa adapter khỏi khu vực làm việc để tránh thao tác nhầm trong quá trình thực hiện.  
• Luôn thực hiện việc phủ tấm dán trên bề mặt đĩa ở các bước như lắc đĩa, trộn dung dịch bằng vortex, bước ly tâm và trong suốt quá trình khuếch đại bằng chu trình nhiệt.  
• Tấm dán loại B (microseal B) phù hợp cho sử dụng trong dải nhiệt độ từ -40oC tới 110oC, cho các đĩa skirted hoặc semiskirted, ở các bước lắc, ly tâm và lưu trữ mẫu trong thời gian dài.  
• Tấm dán loại A (microseal A) phù hợp cho việc sử dụng trong chu trình nhiệt và dễ dàng được cắt bỏ khi số mẫu nhỏ hơn 96.

Chuyển đĩa 

• Khi cần thực hiện chuyển mẫu từ đĩa này sang đĩa khác, cần hút một lượng thể tích xác định từ mỗi giếng và đưa sang giếng tương ứng trên đĩa cần chuyển tới. 

Ly tâm 

• Thực hiện ly tâm ở các bước cần lắng đọng dịch hoặc hạt từ xuống đáy của các giếng, nhằm hạn chế mất mẫu. 

Thao tác với hạt từ 

• Thực hiện việc trộn đều hạt từ bằng pipet một cách nhẹ nhàng, trộn đều hạt từ trong dung dịch. 
• Nếu hạt từ bị hút lên đầu típ, cần đặt cố định đĩa vào giá từ trong khoảng 2 phút, cho đến khi các hạt từ được lắng đọng ở đáy các giếng. 
• Khi thực hiện bước rửa hạt từ, cần sử dụng giá từ phù hợp. 
• Hút loại bỏ dịch rửa sao cho lượng hạt từ trong giếng vẫn còn ẩm. 
• Đặt cố định đĩa trên giá từ đến khi được yêu cầu dừng lại. 
• Không lắc đĩa khi đĩa được đặt trên giá từ. 
• Không khuấy hay phá vỡ các tủa hạt từ dưới đáy giếng. 

6.4. Các bước thực hiện 

Sơ đồ quy trình thực hiện

6.4.1. Cắt gADN và gắn adapter cho các đoạn gADN 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau:

• Đặt máy lắc nhiệt ở 58°C 
• Xác định các loại index adapters trên phần mềm IEM 
• Đánh dấu 1 đĩa midi plate mới với nhãn NLT 

Định lượng và chuẩn hóa nồng độ gADN  

• Định lượng gADN bằng phương pháp phổ huỳnh quang với Qubit 3.0  
• Chuẩn hóa gADN bằng RSB về nồng độ 10 ng/µL.  
• Tái định lượng gADN bằng phương pháp phổ huỳnh quang.  
• Chuẩn hóa gADN bằng RSB về nồng độ 5 ng/µL 

File biểu mẫu lưu trên ổ T: mã biểu mẫu.  Cắt gADN và gắn adapter cho các đoạn gADN. 

• Hút 10 µL Mỗi mẫu gADN nồng độ 5ng/µL ở trên vào các giếng tương ứng trên đĩa NLT 
• Dùng pipet đa kênh bổ sung 25 µL TD vào mỗi giếng 
• Dùng pipet đa kênh bổ sung 15 µL TDE1 vào mỗi giếng 
• Lắc đĩa trong 1 phút ở 1800 vòng/phút 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút 
• Ủ đĩa trong 10 phút ở 58°C, lưu ý đậy nắp để đảm bảo sự phân bố đồng đều về nhiệt độ. 
• Dùng pipet đa kênh bổ sung 15 µL ST vào mỗi giếng 
• Lắc ở 1800 vòng/phút trong 1 phút 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút 
• Ủ đĩa trong 4 phút ở nhiệt độ phòng. 

Lưu ý: Tính toán chính xác lượng DNA đầu vào cho mỗi phản ứng cắt (50ng) để đảm bảo hiệu quả cắt. 

6.4.2. Tinh sạch các đoạn gADN đẵ gắn adapter 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Chuẩn bị mới Ethanol 80%  
• Đánh dấu 1 đĩa Hard-Shell PCR mới với nhãn NLA

Tiến trình 

• Bổ sung 50(*) µL SPB vào mỗi giếng (chú ý vortex thường xuyên và hút chậm). 
• Lắc 1 phút ở 1800 vòng/phút. 
• Ủ đĩa trong 8 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NLT lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2 – 5 phút). 
• Dùng pipet đa kênh hút và loại bỏ dung dịch trong các giếng. 
• Rửa 2 lần như sau: 
  • Bổ sung 200 µL EtOH 80% vào mỗi giếng. 
  • Ủ trên giá từ trong 30 giây. 
  • Hút và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng pipet đa kênh. 
• Dùng pipet đơn kênh 20 µL hút để loại bỏ hoàn toàn EtOH 80% từ mỗi giếng. 
• Để khô tự nhiên trên giá từ trong 10 phút. 
• Gỡ bỏ giá từ. 
• Bổ sung 22.5 µL RSB vào mỗi giếng. 
• Lắc 1 phút ở 1800 vòng/phút. 
• Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NLT lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2 – 5 phút). 
• Chuyển 20 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng của đĩa NLA. 

Lưu ý: ở bước 1, lượng beads SPB sử dụng là 50uL, giảm so với protocol chuẩn là 65 uL. Lý do là để thu được các đoạn DNA có kích thước lớn hơn một chút (size từ 300 – 700 bp).

6.4.3. Khuếch đại các đoạn gADN đã gắn adapter 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Chọn chương trình NLM AMP trong máy PCR, kiểm tra các thông số cài đặt như sau:  
  • Làm nóng lắp ở 100°C  
  • 72°C, 3 phút 
  • 98°C, 30 giây  
  • 10 chu kỳ 
    • 98°C trong 10 giây 
    • 60°C trong 30 giây 
    • 72°C trong 30 giây  
  • 72°C trong 5 phút  
  • Giữ ở 10°C 

Tiến trình 

• Xếp các Index Adapter 1 (i7) (nắp màu cam) theo cột 1-12 trên đĩa TruSeq Index Plate Fixture. 
• Xếp các Index Adapter 2 (i5) (nắp màu trắng) theo hàng A-H trên đĩa TruSeq Index Plate Fixture. 
• Đặt đĩa NLA lên đĩa TruSeq Index Plate Fixture. 
• Dùng pipet đa kênh bổ sung 5 µL mỗi loại Index Adapter 1 (i7) lần lượt theo cột tương ứng. Bỏ nắp ống Index Adapter cũ và thay bằng nắp mới. 
• Dùng pipet đa kênh bổ sung 5 µL mỗi loại Index Adapter 2 (i5) lần lượt theo hàng tương ứng. Bỏ nắp ống Index Adapter cũ và thay bằng nắp mới. 
• Thêm 20 µL NLM vào mỗi giếng. 
• Lắc 1 phút ở 1200 vòng/phút. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NLA vào máy PCR đã cài sẵn chương trình NLM AMP và chạy. 

Điểm tạm dừng an toàn 

• Mẫu thao tác tại thời điểm này có thể được bảo quản ở 2-8 °C tối đa 2 ngày. Hoặc lưu tại máy PCR qua đêm. 

6.4.4. Tinh sạch các đoạn gADN đã được khuếch đại 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Chuẩn bị mới Ethanol 80% 
• Đánh dấu: 
  • 1 đĩa Hard-Shell PCR mới với nhãn NIL 
  • 1 đĩa midi mới với nhãn NLC 

Lưu ý: Phải thực hiện vortex ống đựng beads trước mỗi lần sử dụng. Vortex ống đựng beads sau 6 lần thực hiện hút beads.  Tiến trình 

• Ly tâm đĩa NLA ở 280 x g trong 1 phút. 
• Hút chuyển 50 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng của đĩa NLC. 
• Bổ sung 90 µL SPB vào mỗi giếng. 
• Lắc đĩa NLC trong 1 phút ở 1800 vòng/phút. 
• Ủ đĩa trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm đĩa 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NLC lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2-5 phút). 
• Dùng pipet đa kênh hút và loại bỏ dung dịch trong các giếng. 
• Rửa 2 lần như sau: 
  • Bổ sung 100 µL EtOH 80% vào mỗi giếng. 
  • Ủ trên giá từ trong 30 giây. 
  • Hút và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng pipet đa kênh. 
• Dùng pipette đơn kênh 20 µL hút hoàn toàn EtOH 80% từ mỗi giếng. 
• Để khô tự nhiên trên giá từ trong 10 phút. 
• Bổ sung 27.5 µL RSB vào mỗi giếng. 
• Lắc ở 1800 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NLC lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (khoảng 2 -5 phút). 
• Chuyển 25 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng trên đĩa NIL. 
• Định lượng thư viện bằng phương pháp phổ huỳnh quang với Qubit 3.0. 

Chú ý: Cần định lượng chính xác nồng độ thư viện, nếu định lượng thư viện không chính xác thì mức độ giải trình tự của các mẫu khác nhau sẽ không đồng đều khi gộp các mẫu. [Tùy chọn]: Kiểm tra kích thước thư viện bằng bộ kít HT ADN NGS 3K Reagent Kit trên máy LabChip GX Touch 24 hoặc bằng bộ KIT Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape trên máy Agilent 2200. Kích thước thư viện trong khoảng 200 bp – 1 kbp.

Hình 2: Ví dụ phân bố thư viện sau khi khuếch đại và trước khi được làm giàu 

Lưu ý: Khoảng kích thước tối ưu là từ 200 – 700 bp. Điều kiện lý tưởng là chỉ xuất hiện 1 peak với kích thước trong khoảng tối ưu. Tuy nhiên, với các trường hợp xuất hiện peak có kích thước lớn hơn 1500 bp, là do gDNA chưa được cắt hoàn toàn, vẫn có thể thực hiện bước tiếp lai với probes đặc hiệu ở công đoạn sau Điểm tạm dừng an toàn 

• Mẫu xử lý tại bước này có thể tạm dừng, dán phủ bề mặt đĩa bằng tấm dán “Microseal B” và bảo quản ở -25°C đến -15°C tối đa 14 ngày. 

6.4.5. Gắn các đầu dò 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Sử dụng chương trình NRC HYB trên máy PCR, kiểm tra các thông số được cài đặt. 
  • Làm nóng nắp ở 100°C. 
  • 95°C, 10 phút 
  • 18 chu kỳ, mỗi chu kỳ 1 phút, bắt đầu từ 94°C, giảm 2°C sau mỗi chu kỳ 
  • Giữ ở 58°C 

Chú ý: ủ 58°C ít nhất 90 phút, và tối đa 24 giờ.  

• Đánh dấu: 1 đĩa Hard-Shell PCR mới với nhãn NEH1.

Gộp thư viện  Kết hợp 500 ng mỗi thư viện ADN. Đảm bảo mỗi thư viện được gắn 1 index duy nhất.

Nếu tổng thể tích thư viện sau khi gộp >40 µL, dùng máy cô chân không với chương trình không gia nhiệt và tốc độ làm khô trung bình để cô đặc xuống 40 µL.  Nếu thể tích thư viện <40 µL thì bổ sung RSB để đạt 40 µL.  Lưu ý: Dung dịch lai ADN với các probe đặc hiệu EHB phải được rã đông ít nhất 30 phút ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra dung dịch EHB đã tan hoàn toàn hay chưa, nếu còn các tinh thể thì cần vortex cho tới khi tan hoàn toàn.  Với các mẻ chạy đủ 12 mẫu, lượng ADN pool cho mỗi plex có thể giảm xuống ở mức tối thiểu là 300 ng/plex (vẫn đảm bảo lượng ADN để lai với probe, và giảm lượng thể tích pool).  Tiến trình 

• Bổ sung các thành phần lần lượt theo thứ tự vào mỗi giếng của đĩa NEH1:

• Lắc đĩa ở 1200 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút.
• Đặt đĩa NEH1 vào máy PCR đã cài sẵn chương trình NRC HYB và chạy. Mỗi giếng phản ứng chứa 100 µL. 
• Ủ đĩa ở 58°C trong ít nhất 90 phút, và tối đa không quá 24 giờ. 

6.4.6. Làm sạch các đoạn ADN đã gắn đầu dò  Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Đặt máy lắc nhiệt cho đĩa midi ở 50°C. 
• Đánh dấu:
  • 1 đĩa midi plate mới với nhãn NEW1. 
  • 1 đĩa Hard-Shell PCR mới với nhãn NEH2.

Tiến trình  Gắn lần 1: 

• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Chuyển toàn bộ (khoảng 100 µL) hỗn hợp từ đĩa NEH1 sang các giếng tương ứng của đĩa NEW1. 

Chú ý: Nếu thể tích phản ứng giảm hơn 15% thì không nên tiếp tục. Nguyên nhân là do nhiệt của nắp máy PCR không đủ hoặc màng dính đĩa không đủ chặt. 

• Bổ sung 250 µL SMB vào mỗi giếng (chú ý vortex thường xuyên và hút chậm). 
• Lắc 5 phút ở 1200 vòng/phút. 
• Ủ 25 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEW1 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2-5 phút). 
• Hút và loại bỏ toàn bộ dung dịch trong mỗi giếng. 
• Gỡ bỏ giá từ. 

Rửa lần 1: 

• Rửa 2 lần như sau: 
  • Bổ sung 200 µL EWS vào mỗi giếng. 
  • Lắc 4 phút ở 1800 vòng/phút. 
  • Pipet cho tan hoàn toàn hạt từ. 
  • Đặt đĩa NEW1 lên máy ổn nhiệt, ủ ở 50°C trong 30 phút. 
  • Đặt đĩa NEW1 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (khoảng 2 phút). 
  • Hút và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng pipet đa kênh. 
  • Gỡ bỏ giá từ. 

Thu mẫu lần 1: 

• Chuẩn bị hỗn hợp elution trong Eppendorf 1.7 ml với tỷ lệ như bên dưới, vortex và ly tâm nhanh. 
  • EE1: 28.5 µL 
  • HP3: 1.5 µL 
• Bổ sung 23.5 µL dung dịch elution vào mỗi giếng. 
• Lắc 1 phút ở 1800 vòng/phút. 
• Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút 
• Đặt đĩa NEW1 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (khoảng 2 phút). 
• Chuyển 21 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng của đĩa NEH2. 18. Bổ sung 4 µL ET2 vào mỗi giếng. 
• Lắc ở 1200 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút.

Điểm tạm dừng an toàn 

• Mẫu xử lý tại bước này có thể tạm dừng, dán phủ bề mặt đĩa bằng tấm dán “Microseal B” và bảo quản ở -25°C đến -15°C tối đa 7 ngày. 

6.4.7. Gắn đầu dò lần thứ 2 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau 

Tiến trình 

• Bổ sung các thành phần lần lượt theo thứ tự vào mỗi giếng của đĩa NEH1:

• Lắc ở 1200 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEH1 vào máy PCR đã cài sẵn chương trình NRC HYB và chạy. Mỗi giếng phản ứng chứa 100 µL. 
• Ủ đĩa ở 58°C trong ít nhất 14.5 giờ, và tối đa 24 giờ.

6.4.8. Làm sạch các đoạn ADN đã gắn đầu dò thứ 2 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau 

• Đặt máy lắc nhiệt cho đĩa midi ở 50°C 
• Đánh dấu:
  • 1 đĩa midi plate mới với nhãn NEW2. 
  • 1 đĩa midi plate mới với nhãn NEC1. 

Tiến trình  Gắn lần 2: 

• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Chuyển toàn bộ (khoảng 100 µL) hỗn hợn từ đĩa NEH1 sang các giếng tương ứng của đĩa NEW2. 

Chú ý: Nếu thể tích phản ứng giảm hơn 15% thì không nên tiếp tục. Nguyên nhân là do nhiệt của nắp máy PCR không đủ hoặc màng dính đĩa không đủ chặt. 

• Bổ sung 250 µL SMB vào mỗi giếng (chú ý vortex thường xuyên và hút chậm). 
• Lắc 5 phút ở 1200 vòng/phút. 
• Ủ 25 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEW2 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2-5 phút). 
• Hút và loại bỏ toàn bộ dung dịch trong mỗi giếng. 
• Gỡ bỏ giá từ. 

Rửa lần 2:

• Rửa 2 lần như sau: 
  • Bổ sung 200 µL EWS vào mỗi giếng. 
  • Lắc 4 phút ở 1800 vòng/phút. 
  • Pipet cho tan hoàn toàn hạt từ. 
  • Đặt đĩa NEW2 lên máy ổn nhiệt, ủ ở 50°C trong 30 phút. 
  • Đặt đĩa NEW2 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (khoảng 2 phút). 
  • Hút và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng pipet đa kênh. 
  • Gỡ bỏ giá từ. 

Thu mẫu lần 2: 

• Chuẩn bị hỗn hợp elution trong Eppendorf 1.7 ml với tỷ lệ như bên dưới, vortex và ly tâm nhanh. 
  • EE1: 28.5 µL 
  • HP3: 1.5 µL 
• Bổ sung 23.5 µL dung dịch elution vào mỗi giếng. 
• Lắc ở 1800 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEW2 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (khoảng 2 phút). 
• Chuyển 21 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng của đĩa NEC1. 
• Bổ sung 4 µL ET2 vào mỗi giếng. 
• Lắc ở 1200 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 

6.4.9. Làm sạch thư viện 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Chuẩn bị mới Ethanol 80%. 
• Đánh dấu 1 đĩa Hard-Shell PCR mới với nhãn NEA. 

Tiến trình 

• Bổ sung 45 µL SPB vào mỗi giếng. 
• Lắc 1 phút ở 1800 vòng/phút. 
• Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEC1 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2-5 phút). 
• Dùng pipet đa kênh hút và loại bỏ dung dịch trong các giếng. 
• Rửa 2 lần như sau: + Bổ sung 200 µL EtOH 80% vào mỗi giếng. + Ủ trên giá từ trong 30 giây. + Hút và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng pipet đa kênh.
• Dùng pipette đơn kênh 20 µL hút hoàn toàn EtOH 80% từ mỗi giếng. 
• Để khô tự nhiên trên giá từ trong 10 phút. 
• Gỡ bỏ giá từ. 
• Bổ sung 27.5 µL RSB vào mỗi giếng. 
• Lắc ở 1800 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (khoảng 2 phút). 
• Chuyển 25 µL dịch nổi từ các giếng trên đĩa NEC1 sang các giếng tương ứng trên đĩa NEA. 

Điểm tạm dừng an toàn 

• Mẫu xử lý tại bước này có thể tạm dừng, dán phủ bề mặt đĩa bằng tấm dán “Microseal B” và bảo quản ở -25°C đến -15°C tối đa 7 ngày

6.4.10. Khuếch đại thư viện đã làm giàu 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau

• Chọn chương trình AMP12 đã được cài đặt sẵn trên máy PCR. Kiểm tra các thông số như bên dưới: 
  • Làm nóng nắp ở 100𝇈C. 
  • 98°C, 30 giây 
  • 12 chu kỳ 
    • 98°C trong 10 giây 
    • 60°C trong 30 giây 
    • 72°C trong 30 giây 
  • 72°C trong 5 phút 
  • Giữ ở 10𝇈C 

Tiến trình 

• Thêm 5 µL PPC vào mỗi giếng. 
• Thêm 20 µL NEM vào mỗi giếng. 
• Lắc 1 phút ở 1200 vòng/phút. 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEA vào máy PCR đã cài sẵn chương trình AMP10 hoặc AMP12 và chạy. Mỗi phản ứng có thể tích 50 µL. 

Điểm tạm dừng an toàn 

• Mẫu xử lý tại bước này có thể tạm dừng, dán phủ bề mặt đĩa bằng tấm dán “Microseal B” và bảo quản ở 2-8 °C trong tối đa 2 ng

6.4.11. Làm sạch thư viện đã được khuếch đại và làm giàu 

Chuẩn bị hóa chất và vật tư tiêu hao 

• Chuẩn bị các hóa chất sau 

• Chuẩn bị mới Ethanol 80% 
• Đánh dấu:
  • 1 đĩa midi mới với nhãn NEC2. 
  • 1 đĩa Hard-Shell PCR mới với nhãn NEL

Tiến trình 

• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Chuyển 50 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng của đĩa NEC2. 
• Bổ sung 90 µL SBP vào mỗi giếng. 
• Lắc ở 1800 vòng/phút trong 1 phút. 
• Ủ đĩa trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEC2 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2-5 phút). 
• Dùng pipet đa kênh hút và loại bỏ dung dịch trong các giếng. 
• Rửa 2 lần như sau: 
  • Bổ sung 200 µL EtOH 80% vào mỗi giếng. 
  • Ủ trên giá từ trong 30 giây. 
  • Hút và loại bỏ hoàn toàn dịch rửa bằng pipet đa kênh. 
• Dùng pipette đơn kênh 20 µL hút hoàn toàn EtOH 80% từ mỗi giếng. 
• Để khô tự nhiên trên giá từ trong 10 phút. 
• Gỡ bỏ giá từ. 
• Bổ sung 32 µL RSB vào mỗi giếng. 
• Lắc 1 phút ở 1800 vòng/phút. 
• Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 2 phút 
• Ly tâm 280 x g trong 1 phút. 
• Đặt đĩa NEC2 lên giá từ và đợi cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn (2-5 phút). 
• Chuyển 30 µL dung dịch trong sang các giếng tương ứng của đĩa NEL. 

Điểm tạm dừng an toàn  

• Mẫu xử lý tại bước này có thể tạm dừng, dán phủ bề mặt đĩa bằng tấm dán “Microseal B” và bảo quản ở -25°C đến -15°C tối đa 7 ngày. 

6.4.12. Kiểm tra chất lượng thư viện đã làm giàu

Định lượng thư viện

• Định lượng thư viện bằng phương pháp huỳnh quang với Qubit 3.0. Pha loãng thư viện đã làm giàu theo tỉ lệ: 1 µL library : 29 µL RSB (với từ 3 tới 12 mẫu được gộp trong cùng 1 ống) hoặc tỉ lệ 1 µL library : 15 µL RSB (với 1 hoặc 2 mẫu gộp). 
• Sử dụng công thức sau để chuyển nồng độ thư viện từ ng/µL về nM. Giả sử kích thước trung bình của thư viện là 400 bp

Ví dụ: Đánh giá chất lượng thư viện  Kiểm tra kích thước thư viện bằng bộ kit HT ADN NGS 3K Reagent Kit trên máy LabChip GX Touch 24 hoặc bằng bộ KIT Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape trên máy Agilent 2200.  Kích thước thư viện trong khoảng 200 bp – 1kbp

Hình 3: Ví dụ phân bố của thư viện đã được khuếch đại và làm giàu 

Lưu ý:  Nồng độ thư viện thu được giao động trong khoảng từ 5-15 ng/uL, nếu lớn hơn thì cần xem lại quy trình thực hiện, kết hợp với kết quả chạy Tapes để đưa ra quyết định có lên máy hay không. Trong trường hợp thư viện xuất hiện thêm 01 peak có kích thước lớn trong khoảng từ 1500-3000, không đưa peak có kích thước lớn này vào vùng lựa chọn để tính size trung bình. Trong trường hợp chỉ có 1 peak, nhưng kích thước lớn, size trung bình khoảng 700-800 bp, thì cần phải kiểm tra hóa chất lai, capture và thực hiện lại việc chuẩn bị thư viện. 

6.4.13. Giải trình tự trên máy MiSeq 

Sau khi tạo được thư viện với nồng độ chuẩn hóa tại bước 6.4.12; tiến hành giải trình tự trên máy MiSeq theo quy trình có tên “Quy trình giải trình tự trên máy MiSeq” mã số DTYH_33_Giải trinh tự MiSeq_XNG064-v2-300 cycles.docx (lưu trên ổ chung của DTYH, phần SOPs). 

6.4.14. Phân tích kết quả xét nghiệm 

Kết thúc quá trình giải trình tự, File dữ liệu được chuyển từ máy giải trình tự sang máy tính để tiến hành phân tích và báo cáo biến dị. Thao tác tuân thủ theo quy trình có tên “Quy trình phân tích và báo cáo biến dị cho xét nghiệm sàng lọc ung thư di truyền” mã số DTYH_34_Quy trinh phan tich va bao cao bien di.docx (lưu trên ổ chung của DTYH, phần SOPs). 

7. Kiểm soát chất lượng 

7.1. Yếu tố ảnh hưởng  

• Bộ sinh phẩm, hóa chất đã hết hạn sử dụng.  
• Trộn lẫn các thành phần của bộ sinh phẩm ở các lô sản xuất khác nhau có thể ảnh hưởng tới tính chính xác của xét nghiệm  
• Sự nhiễm khuẩn và nhiễm chéo giữa các thành phần (do sử dụng các vật tư không được khử trùng hoặc sử dụng chung các đầu tip hay trao đổi nắp giữa các thành phần).  
• Nồng độ mẫu ADN khuôn quá cao có thể làm giảm độ nhạy của xét nghiệm. 

7.2. Chỉ tiêu chất lượng của thư viện bao gồm kích thước và nồng độ thư viện

• Kích thước thư viện đạt yêu cầu khi nằm trong khoảng từ 200 bp – 1 kbp với peak ở khoảng 300-400 bp.  
• Nồng độ thư viện dao động từ 30-100 ng/µL. 

8. Xử lý mẫu và chất thải  

• Mẫu sau khi thực hiện xét nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ -80𝇈C trong 3 năm.  
• Tuân thủ quy trình xử lý chất thải y tế.  
• Tiến hành vệ sinh các thiết bị và bề mặt xét nghiệm bằng cồn 70%. 

Phụ lục 1. Phiếu kết quả âm tính  Phụ lục 2. Biểu mẫu theo dõi thực hiện chuẩn bị thư viện cho xét nghiệm sàng lọc ung thư di truyền Phụ lục 3. Checklist quy trình trả kết quả XNG-064

Tài liệu tham khảo/liên quan 

• TruSight Rapid Capture Reference Guide 
• Quy trình giải trình tự trên máy MiSeq 
• Quy trình phân tích và báo cáo biến dị cho xét nghiệm sàng lọc ung thư di truyền 

Các từ viết tắt 

• TS: TruSight 
• EE1: Enrichment Elution Buffer 1 
• EHB: Enrichment Hybridization Buffer 
• ET2: Elute Target Buffer 2 
• EWS: Enrichment Wash Solution 
• HP3: 2N NaOH 
• NEA: Nextera Enrichment Amplification Plate 
• NEC1: Nextera Enriched Clean Up Plate 1 
• NEC2: Nextera Enriched Clean Up Plate 2 
• NEH1: Nextera Enrichment Hyb Plate 1 
• NEH2: Nextera Enrichment Hyb Plate 2 
• NEL: Nextera Enrichment Library Plate 
• NEM: Enrichment Amp Mix 
• NEW1: Nextera Enrichment Wash Plate 1 
• NEW2: Nextera Enrichment Wash Plate 2 
• NIL: Nextera Index Library Plate 
• NLA: Nextera Library Amplification Plate 
• NLC: Nextera Library Clean Up Plate 
• NLM: Library Amp Mix 
• NLT: Nextera Library Tagment Plate 
• PPC: PCR Primer Cocktail 
• RCO: Rapid Capture Oligos 
• RSB: Resuspension Buffer 
• SMB: Streptavidin Magnetic Beads 
• SPB: Sample Purification Beads 
• ST: Stop Tagment Buffer 
• TD: Tagment DNA Buffer 
• TDE1: Tagment DNA Enzyme TDE

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0