Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xét nghiệm Aspergillus galactomanan

Người thẩm định: Đoàn Mai Phương
Người phê duyệt: Phùng Nam Lâm
Ngày phát hành: 16/05/2022

1. Mục đích xét nghiệm Aspergillus galactomanan

Mô tả cho nhân viên phòng Xét nghiệm về các bước thực hiện ELISA để phát hiện định lượng kháng nguyên Aspergillus galactomannan trong huyết thanh và dịch phế quản, để chẩn đoán nhiễm Aspergillus bằng bộ kit Dynamiker Aspergillus galactomannan (Trung Quốc).

2. Phạm vi

Quy trình này áp dụng cho mọi nhân viên phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện đa khoa Quốc tế Vinmec Times City.

3. Trách nhiệm

• Nhân viên được giao nhiệm vụ thực hiện xét nghiệm này tuân thủ đúng quy trình.
• Trưởng đơn nguyên, kỹ thuật viên trưởng đơn nguyên Vi sinh, trưởng tua trực chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ đúng quy trình.

4. Định nghĩa và từ viết tắt

5. Nguyên lý

Hút huyết thanh/ dịch phế quản đã được xử lý và kháng thể kháng galactomannan tương ứng vào các giếng đã được phủ với kháng nguyên galactomannan và ủ. Sau khi rửa loại bỏ các thành phần không liên kết, hút conjugate vào các giếng và ủ. Lặp lại bước rửa, thêm substrate solution vào các giếng và ủ. Thêm dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào. Đo ở bước sóng 450nm bằng máy đọc ELISA. Cường độ lên màu tỉ lệ nghịch với nồng độ galactomannan trong bệnh phẩm.

6. Loại mẫu sử dụng

Huyết thanh chứa trong các ống chuẩn lấy mẫu hoặc các ống chứa gel tách:

• Huyết tương chống đông bằng natri heparin, EDTA và huyết tương được lấy bằng các ống chứa gel tách.
• Yêu cầu:
  • Bệnh phẩm phải được vận chuyển đến phòng Vi sinh càng sớm càng tốt hoặc theo quy định trong Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm.
  • Nếu trì hoãn, ở 2 – 8 độ C trong 9 ngày hoặc -20 độ C trong 3 tháng. Mẫu có thể rã đông 6 lần.
  • Thể tích mẫu tối thiểu yêu cầu là 170 μL (20 μL cho xét nghiệm, 150 μL thể tích chết).
  • Không sử dụng các mẫu bị bất hoạt bởi nhiệt.
  • Để các mẫu về nhiệt độ 20 – 25 độ C trước khi tiến hành đo.

    

7. Trang thiết bị và vật tư

7.1. Thiết bị

• Máy đọc ELISA (ELISA reader).
• Đồng hồ bấm giờ.
• Tủ ấm.
• Máy vortex.
• Máy ly tâm.

7.2. Vật liệu

• Dụng cụ:
  • Pipettes: Pipettes eppendorf 1000 μl (dùng để hút Diluent buffer), 200 μl (dùng để hút mẫu đã được pha loãng), 20 μl (dùng để hút huyết thanh bệnh nhân).
  • Ống đong.
• Hóa chất:
  • Bộ hóa chất của hãng Dynamiker:

• Nước cất 2 lần
• Vật tư tiêu hao:
  • Giấy thấm.
  • Đầu côn 200 μl, 1000 μl: Hãng Kima, Ý.
  • Ống cup.
  • Găng tay, khẩu trang.

8. Chuẩn bị bệnh nhân

Không áp dụng

9. Quy trình thực hiện xét nghiệm Aspergillus galactomanan

9.1. Xử lý huyết thanh

• Hút 300 μL huyết thanh cho vào ống Eppendorf.
• Hút 100μL dung dịch xử lý mẫu (R5) vào mỗi ống.
• Vortex 10 giây. Ủ 1000 C trong 3 phút.
• Ly tâm 13000 vòng/10 phút.
• Hút 50μL dung dịch nổi để thử nghiệm.

9.2. Xử lý dịch phế quản

• Hút 400μL dịch phế quản vào ống Eppendorf.
• Vortex 10 giây.
• Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

9.3. Chuẩn bị phản ứng

• Cho tất cả hóa chất ra nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi sử dụng.
• Pha dung dịch rửa: pha loãng dung dịch rửa 20x với tỉ lệ 1:20 bằng nước cất 2 lần.
• Chuẩn bị sơ đồ mẫu cho xét nghiệm.

9.4. Tiến hành 

• Bước 1:
  • Hút 50μL standard (a, b, c, d, e), Control (A, B) và mẫu vào các giếng theo sơ đồ.
  • Hút 50μL kháng thể kháng galactomannan (R3) vào mỗi giếng.
  • Thêm 100μL dung dịch pha loãng mẫu (R7) vào giếng trắng.
  • Lắc nhẹ trong 10 giây. Phủ bằng . Ủ 37 độ C trong 90 phút.
• Bước 2: Rửa.
  • Đổ bỏ tất cả phần chất lỏng có trong giếng.
  • Thêm đầy dung dịch rửa đã pha loãng ở trên (300μL) vào các giếng, lắc nhẹ sau đó đổ bỏ.
  • Lặp lại quá trình này trong 3 lần.
  • Thấm dung dịch thừa bằng giấy thấm.
• Bước 3: Thêm Enzyme conjugate.
  • Hút 100 μl dung dịch Enzyme conjugate vào các giếng phản ứng
  • Ủ ở nhiệt độ phòng trong 370 C trong 30 phút.
• Bước 4: Rửa.
  • Làm như bước 2
  • Gõ giá vào giấy thấm sao cho loại bỏ được hết chất lỏng có trong các giếng phản ứng.
• Bước 5: Thêm dung dịch Chromogen.
  • Hút 100 μl Substrate solution (R8) vào mỗi giếng
  • Ủ ở nhiệt độ 370 C trong 15 phút
• Bước 6: Thêm dung dịch Stop solution.
  • Thêm 50 μl vào mỗi giếng.
  • Gõ nhẹ giếng phản ứng.
• Bước 7: Đọc bằng máy ELISA ở bước sóng 450nm trong vòng 5 phút sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng.

9.5. Lưu hủy mẫu bệnh phẩm

Theo Quy trình lưu và hủy mẫu bệnh phẩm sau xét nghiệm.

10. Kiểm tra chất lượng

Kiểm tra chất lượng của test phản ứng thông qua mẫu chứng âm và mẫu chứng dương.

• Giếng trắng: OD < 0.2.
• Chứng dương: Nồng độ phải từ 2.5-5.0μg/L.
• Chứng âm: Nồng độ phải < 0.5μg/L.
• R2 của đường chuẩn phải ≥ 0.98.

11. An toàn

• Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo Chương trình an toàn phòng xét nghiệm.
• Thực hiện bảo hộ cá nhân đầy đủ khi tiếp xúc với các bệnh phẩm và tránh nhiễm chéo và không lây nhiễm cho nhân viên y tế.
• Trong trường hợp đánh đổ bệnh phẩm, phải cẩn thận làm sạch nơi bị đổ cùng với chất sát khuẩn để đảm bảo an toàn sinh học.

12. Dải đo

Không áp dụng

13. Diễn giải và báo cáo kết quả xét nghiệm Aspergillus galactomanan

• Mẫu dương: nồng độ galactomannan > 0.85μg/L.
• Mẫu âm: nồng độ galactomannan < 0.65μg/L.
• Ngưỡng nghi ngờ: nồng độ galactomannan trong khoảng 0.65-0.85μg/L.

14. Các yếu tố ảnh hưởng

• Hiện tượng chứng âm có độ hấp thụ cao không như mong đợi có thể xảy ra do quá trình rửa không đảm bảo hoặc chưa loại bỏ hết các thành phần còn lại của giếng ở bước 5.
• Số lượng cá nhân dương tính có thể thay đổi giữa các quần thể các vùng địa lý. Nếu có thể, mỗi phòng thí nghiệm cần thiết lập một giá trị.

15. Lưu hồ sơ

Ghi chép rõ ràng kết quả vào hệ thống mạng Labconn.

16. Tài liệu liên quan

• Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm.
• Quy trình lưu và hủy bệnh phẩm sau xét nghiệm.

17. Tài liệu tham khảo

Hướng dẫn sử dụng Dynamiker Aspergillus galactomannan (Trung Quốc) Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0