Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xác định trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh bằng hệ thống phân tích MSI

Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Ngày phát hành: 26/08/2021 

1. Mục đích  

• Hướng dẫn cho nhân viên phòng thí nghiệm thực hiện quy trình xác định trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh bằng hệ thống phân tích MSI, phiên bản 1.2 (Promega).  

• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện

2. Nguyên lý  

• Hệ thống phân tích MSI, phiên bản 1.2, sử dụng kỹ thuật PCR huỳnh quang để phát hiện sự mất ổn định của trình tự vi vệ tinh trong tế bào người. Hệ thống phân tích MSI sử dụng những mồi gắn huỳnh quang để đồng thời nhân bản 7 trình tự vi vệ tinh, bao gồm 5 vi vệ tinh với một nucleotit lặp lại (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 và MONO-27) và hai vi vệ tinh với 5 nucleotit lặp lại (Penta C and Penta D) (Hình 1 và bảng 1). Vi vệ tinh với một nucleotit lặp lại được dùng để xác định trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh, và vi vệ tinh với 5 nucleotit lặp lại được dùng để loại bỏ khả năng bị nhiễm mẫu. Thang kích thước chuẩn được bổ sung vào sản phẩm PCR để đảm bảo độ chính xác về kích thước của alen và kiểm soát sự khác biệt của mỗi lần phân tích. Sản phẩm PCR sẽ được tách ra bằng phương pháp điện di mao quản, và phân tích bằng phần mềm GeneMapper® software (Applied Biosystems) để xác định trạng thái mất ổn định trình tự vệ tinh của mẫu xét nghiệm.

Hình 1: Biểu đồ hiển thị vị trí của 5 trình tự vi vệ tinh với một nucleotit lặp lại, hai trình tự vi vệ tinh với năm nucleotit lặp lại, và thang kích thước chuẩn 600. 

Bảng 1: Thông tin về trình tự của các vi vệ tinh được phân tích bằng hệ thống phân tích MSI

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan  

• Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó.  
• Điện di mao quản sử dụng lực điện từ để tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau

4. Thiết bị/ vật tư tiêu hao/ Hóa chất 

4.1. Thiết bị

Các thiết bị cần để thực hiện xét nghiệm này được đề cập trong mục 4.1 (Thiết bị) của “Quy trình xét nghiệm bất thường nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y bằng kỹ thuật sinh học phân tử QF-PCR

4.2. Vật tư tiêu hao

Các thiết bị cần để thực hiện xét nghiệm này được đề cập trong mục 4.2 (Vật tư tiêu hao) của “Quy trình xét nghiệm bất thường nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X và Y bằng kỹ thuật sinh học phân tử QF-PCR”

4.3. Hóa chất 

5. An toàn  

Các yêu cầu về an toàn phòng xét nghiệm được đề cập tại mục 5 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu (1 cặp mồi) 

6. Quy trình thực hiện 

6.1. Loại mẫu  

• 2ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông bằng EDTA, bảo quản ở 4 độ C
• Mẫu khối nến FFPE hoặc mẫu dịch cổ trướng (Ascitic fluid). 

6.2. Tiếp nhận mẫu  

•  Thực hiện các bước như đã đề cập trong mục “6.2. Tiếp nhận mẫu” của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau” 

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình  

• Lập biểu mẫu “Xác định trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh bằng hệ thống phân tích MSI” (BM01-XP019), lưu bản mềm trên máy tính, ổ lưu dữ liệu chung của của Khối Di truyền Y học (DTYH).  
• Rã đông hoàn toàn các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng.  

6.4. Các bước tiến hành 

• Tách DNA 
  • Tách DNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, Cat No./ID: 56404), sử dụng biểu mẫu “Tách chiết DNA” thực hiện trong phòng tách chiết mẫu, theo quy trình kỹ thuật “Tách chiết DNA từ mẫu mô trong khối nến”.  
  • Xác định độ tinh sạch và nồng độ của DNA sau tách chiết bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng của DNA, sử dụng máy NanoDrop 
  • Nồng độ của DNA sau tách chiết nằm trong khoảng 20-125 ng/ μl được coi là đạt. 
  • Tỉ lệ độ hấp thụ đo được tại bước sóng 260 và 280 nm (A260/A280) nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 thì DNA thu hồi được coi là tinh sạch.  

• Chuẩn bị Hỗn hợp phản ứng cho PCR (tại phòng Pre PCR) 

• Tra mẫu DNA vào HHPƯ (tại phòng PCR): 
  • Thực hiện tra khuôn DNA trong tủ PCR Cabinet (thao tác với mẫu DNA đã tách chiết) 
  • Chuẩn bị các mẫu DNA đã tách chiết. 
  • Khởi động máy PCR ít nhất 5 phút trước khi thực hiện chương trình nhiệt. 
  • Trộn đều và ly tâm nhanh các ống chứa mẫu đã được chuẩn bị trước.  
  • Kiểm tra các mẫu DNA đã được sắp xếp theo thứ tự phù hợp. 
  • Tra 2 µl DNA mẫu (đã pha loãng về nồng độ 1-2 ng/µl) vào các tuýp PCR tương ứng chứa HHPƯ, mix bằng pipet 3 lần. 
  • Ly tâm nhanh các tuýp PCR.  

• Thực hiện phản ứng PCR (tại phòng Post-PCR) 
  • Đặt các tuýp PCR vào máy PCR tương ứng 
  • Lựa chọn chương trình nhiệt PCR đã được cài đặt trên máy, tên chương trình PCR là “MSI”. Kiểm tra tổng thể tích phản ứng là 25 µl.

• Kết thúc phản ứng PCR, bảo quản sản phẩm PCR tại tủ lạnh lưu mẫu -20 độ C. 
• Điện di mao quản Bước này cần đặc biệt chú ý các thao tác và thông số như sau: 
  • Khởi động máy điện di mao quản 3500Dx (ABI) ít nhất 15 phút trước khi chạy điện di. 
  • Chuẩn bị mẫu loading cocktail bằng cách trộn 2 μl của Size standard (560 SIZER ORANGE) với 100 μl Hi- Di formamide (đủ cho 06 mẫu). 
  • Tính toán số lượng mẫu và chuẩn bị thể tích hỗn hợp loading cocktail cho phù hợp. 
  • Vortex trong vòng 15 giây. 
  • Chia 15 µl loading cocktail vào đĩa 96 giếng Microwell trên máy ABI 3500Dx theo đúng vị trí đã nêu trong biểu mẫu (BM01-XP019). 
  • Thêm 1.5 μl sản phẩm PCR của các mẫu vào các giếng tương ứng. 
  • Đặt tấm phản ứng vào vị trí khay mẫu trên máy ABI 3500Dx. 
  • Thực hiện điện di mao quản theo hướng dẫn:  
    • Kiểm tra tình trạng sinh phẩm điện di mao quản: trên màn hình chính (Dashboard) của phần mềm, kiểm tra các thông số đo của Polymer, Anode buffer, Cathode buffer và mao quản.  
    • Hạn sử dụng của sinh phẩm.  
    • Lượng sinh phẩm còn lại đủ để thực hiện điện di mao quản. 

• Cài đặt nhiệt độ chạy máy, chọn Start Pre-heat. 
• Kiểm tra bọt khí bên trong hệ thống bơm. Nếu có bọt khí, thực hiện đuổi bọt khí theo chương trình Remove Bubble wizard và làm theo hướng dẫn. 
• Khai báo thông tin lần chạy:  
  • Trên màn hình chính (Dashboard), chọn Create new plate.  
  • Hộp thoại Template xuất hiện, lựa chọn:  
  • Number of well: 96  
  • Plate type: Fragment  
  • Capillary Length: 50 cm  
  • Polymer: POP7  
  • Sample names and sample types: Khai báo vị trí mẫu, tên mẫu.  
  • Assay: QF-PCR  
  • Hiệu điện thế đầu vào: 1.6 kv  
  • Thời gian đầu vào: 15 giây 
  • Hiệu điện thế chạy: 19.5 kv  
  • Thời gian chạy: 1500 giây 

• Results group: lựa chọn folder MSI lưu kết quả. 
• Chọn Link plate for run. 
• Chọn Start run. 

6.5. Phân tích và báo cáo kết quả  

• Phân tích kết quả 
  • Phát hiện trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh dựa trên sự so sánh kích thước trình tự vi vệ tinh của mẫu DNA bệnh với mẫu DNA bình thường từ cùng một cơ quan của một cá thể. Sự xuất hiện của những alen mới trong mẫu bệnh ám chỉ trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh trong mẫu bệnh (Hình 2). Hệ thống phân tích MSI cho phép phát hiện đồng thời một tổ hợp các vi vệ tinh. 
  • Kết quả dương tính đối với sự mất ổn định trình tự vi vệ tinh được xác định bằng sự thay đổi chiều dài của các trình tự vi vệ tinh bởi vì sự thêm hoặc bớt của các đơn vị lặp lại. Sự thêm hoặc bớt các đơn vị lặp lại trong mẫu bệnh tạo ra các alen có chiều dài khác biệt so với mẫu bình thường. 
  • Thông thường, những mẫu bệnh có ≥40% (≥2 trên 5 trình tự vi vệ tinh thay đổi) trình tự vi vệ tinh bị thay đổi sẽ được xếp loại là trạng thái mất ổn định cao (MSI-H). Những mẫu bệnh có ít hơn 40% (<2 trên 5 trình tự vi vệ tinh thay đổi) trình tự vi vệ tinh bị thay đổi sẽ được xếp loại là trạng thái mất ổn định không cao (nonMSI-H). 

Hình 2: Biểu đồ của tổ hợp vi vệ tinh trong mẫu bình thường (trên) và kết quả dương tính đối với sự mất ổn định của trình tự vi vệ tinh trong mẫu bệnh (dưới) được xác định bằng hệ thống phân tích MSI. Sự xuất hiện của alen mới trong mẫu bệnh (đánh dấu bằng mũi tên), những cái không được phát hiện trong mẫu bình thường, ám chỉ trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh trong mẫu bệnh.  

• Phê duyệt và báo cáo kết quả 
  • Trình bộ kết quả sau cho phụ trách Khối Di truyền Y học hoặc người được phân công đánh giá và xác nhận kết quả:  
    • Biểu mẫu xét nghiệm “Xác định trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh bằng hệ thống phân tích MSI” (BM01-XP019).  
    • Bản in màu kết quả điện di mao quản.

• Sau khi Phụ trách đã xem xét và phê duyệt hồ sơ xét nghiệm và kết quả xét nghiệm, người thực hiện xét nghiệm chịu trách nhiệm lập phiếu trả kết quả xét nghiệm và công bố kết quả xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật “Quy trình trả kết quả xét nghiệm” (QTKT06). 

7. Kiểm soát chất lượng  

• Lượng DNA đầu vào tối thiểu là 3ng (0,6 – 6 ng/µl); 260/280 = 1.8-2.0; 260/230 >/=2.  
• Cường độ tín hiệu của các đỉnh STS > 100 RF

8. Xử lý mẫu và chất thải  

• Đã được đề cập ở mục 8 của ‘ Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu – 1 cặp mồi” . 

9. Biểu mẫu/ bảng kiểm/ phụ lục  

• Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi xét nghiệm: BM01: XP-019 

• Phụ lục 2: Phiếu trả kết quả xét nghiệm: BM02: XP-019

• Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện quy trình xác định trạng thái mất ổn định của trình tự vi vệ tinh bằng hệ thống phân tích MSI  

• Phụ lục 4: Bảng kiểm thực hiện quy trình 

Tài liệu tham khảo 

• QIAamp DNA Mini Blood Mini Handbook, QIAGEN. 
• MSI Analysis System Version 1.2 Protocol. 
• Hướng dẫn sử dụng máy 3500Dx (ABI)

Từ viết tắt:  

• DNA: Deoxyribonucleic Acid  
• PCR: Polymerase Chain Reaction  
• HHPƯ: Hỗn hợp phản ứng  
• DTYH: Di truyền Y học 
• MSI: Microsatellite Instability 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó

0