Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng y học tái tạo
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích

• Hướng dẫn cho nhân viên khối Di truyền y học hiện kỹ thuật xác định mất đoạn nhỏ AZF trên nhiễm sắc thể Y bằng bộ sinh phẩm Devyser AZF v2.
• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện

2. Nguyên lý

• Phương pháp xác định mất đoạn nhỏ AZF trên nhiễm sắc thể Y bằng bộ sinh phẩm Devyser
• AZF v2 dựa theo phương pháp PCR đa mồi khuếch đại các đoạn gen đặc hiệu (sequence-tagged sites) nằm trên vùng AZFa, AZFb và AZFc trên nhiễm sắc thể Y.
• Sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng hệ thống điện di mao quản. Sự có mặt hoặc vắng mặt của các đoạn gen đích cho thấy sự có mặt hoặc mất đoạn vùng gen đang xét. Marker ZFXY là marker nội chứng của xét nghiệm (vùng gen có mặt trên cả nhiễm sắc thể X và Y)

3. Định nghĩa và các khái niệm liên quan 

• AZF: Azoospermia factor
• QF-PCR: Quantitative fluorescence polymerase chain reaction.

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất xác định mất đoạn nhỏ AZF trên nhiễm sắc thể Y

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất

5. An toàn

• Nhân viên thực hiện mang trang bị bảo hộ khi làm việc theo SOP-VNC-59.
• Tuân thủ theo đúng các hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm
• Tuân thủ đúng hướng dẫn của quy trình này
• Xử lý rác thải theo SOP-VNC-62

6. Quy trình kỹ thuật thực hiện

6.1. Loại mẫu

• 2ml mẫu máu toàn phần đựng trong tube lấy máu có chống đông EDTA (ống nắp tím)

6.2. Tiếp nhận mẫu

• Mẫu tiếp nhận theo quy trình phối hợp nhận mẫu với Khoa xét nghiệm

6.3. Trước mỗi giai đoạn của quy trình xét nghiệm

• Kiểm tra và khởi động các thiết bị cần sử dụng: Khởi động máy PCR ít nhất 5 phút trước khi thực hiện chương trình nhiệt.
• Khử nhiễm dụng cụ, thiết bị, bề mặt, không gian làm việc bằng ethanol 70%
• Kiểm tra và chuẩn bị đủ vật tư tiêu hao và dụng cụ cần thiết như đầu côn, pipet, giá đựng ống nghiệm, khay lạnh, bình đá vẩy.

6.4. Các bước tiến hành

• Sử dụng bộ sinh phẩm QIAGEN DNA Mini Blood Kit (QIAGEN, REF 51104), sử dụng biểu mẫu “Tách chiết DNA” thực hiện trong phòng tách chiết mẫu, theo quy trình kĩ thuật “Tách chiết DNA tổng số (QIAGEN)” (QTKT03).

6.5. Chuẩn bị master mix cho PCR

• Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (HHPƯ) (tại phòng pha mix, chỉ làm một lần khi mở bộ sinh phẩm):
  • Rã đông các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng trong 15 phút:
    • Ống AZF v2
    • Ống PCR Activator
  • Khi đã tan đông hoàn toàn, giữ các ống trên khay lạnh.
  • Chuẩn bị các ống PCR 0.2ml và ghi nhãn AZF
  • Tra 500 μl dung dịch từ ống AZF v2 vào ống PCR Activator
  • Trộn đều và ly tâm nhanh
  • Chia 20μl hỗn hợp AZF/Activator vào các ống PCR 0.2ml đã chuẩn bị
  • Bảo quản các ống Master mix (PCR 0.2ml) trong tủ -20oC
  • Lấy số lượng tube Master mix tương ứng với số mẫu cần xét nghiệm chuyển sang phòng tra mẫu.
• Tra mẫu ADN vào HHPƯ trong tủ an toàn sinh học (tại phòng PCR):
  • Ghi nhãn ống Master mix theo tên mẫu tương ứng
  • Trộn đều và spindown các ống chứa mẫu đã được chuẩn bị trước.
  • Kiểm tra các mẫu ADN đã được sắp xếp theo thứ tự phù hợp.
  • Thêm 5 μl mẫu DNA vào tube Master mix tương ứng. Trộn đều bằng pipet và ly tâm nhanh

6.6. Thực hiện phản ứng PCR (tại phòng PCR)

• Đặt các ống phản ứng vào máy PCR
• Lựa chọn chương trình nhiệt “AZF” đã được cài đặt trên máy.

• Kết thúc phản ứng PCR, bảo quản các ống phản ứng tại tủ lạnh lưu mẫu 4oC (tủ lạnh 2).

6.7. Điện di mao quản (tại phòng 4199)

• Bật máy ABI 3500Dx ít nhất 15 phút trước khi sử dụng
• Rã đông các dung dịch sau để chuẩn bị dung dịch Loading:
  • Hi- Di formamide
• Size standard 560
• Khi đã tan đông hoàn toàn, giữ các ống trên khay lạnh.
• Chuẩn bị 1 ống PCR 1.5ml ghi nhãn Loading
• Tra 100 μl Hi- Di formamide vào ống Loading
• Tra 2μl Size standard vào ống Loading đã chứa Hi-Di
• Trộn đều và ly tâm nhanh
• Chia 15μl loading vào các giếng đã xác định trên tấm PCR 96 giếng
• Thêm 1,5μl mẫu PCR vào các giếng chứa dung dịch loading tương ứng
• Đặt tấm phản ứng vào máy ABI 3500Dx.
• Từ màn hình Dashboard, kiểm tra và đảm bảo:
  • Hóa chất điện di vẫn còn hạn
  • Lượng hóa chất còn lại đủ để thực hiện xét nghiệm
• Khai báo lần chạy:
  • Từ màn hình Dashboard, chọn Create new plate
  • Màn hình teamplate xuất hiện, chọn:
    • Number of well: 96
    • Plate type: Fragment
    • Capillary Length: 50 cm
    • Polymer: POP7
    • Sample names and sample types: sample positions, sample names
    • Assay: QF-PCR
    • Results group: QF
  • Chọn Link plate for run
  • Chọn Start run

7. Phân tích và báo cáo kết quả

7.1. Nhập dữ liệu vào phần mềm phân tích

• Mở và đăng nhập vào phần mềm Genemapper
• Từ màn hình chính, chọn File – Add samples to Project – Chỉ đường dẫn tới file điện di mao quản (ABI files)
• Từ giao diện phần mềm Genemapper, khai báo:
  • Analysis method: Devyser AZF v2
  • Panel: Deviser AZF v2
  • Size Standard: 560_SIZER_ORANGE
• Chọn Analyze để phân tích

7.2. Tiêu chuẩn chấp nhận

• Cường độ tín hiệu mẫu (Relative fluorescent units) của mỗi marker phải lớn hơn 200 RFU
• Mẫu chứng dương: Tất cả các marker (8 marker) đều xuất hiện

Kết quả của mẫu chứng dương

• Mẫu chứng âm: Không xuất hiện marker nào trong khoảng từ 110 đến 480bp

7.3. Phân tích kết quả

• Quan sát và đánh giá số lượng marker xuất hiện và kích thước của chúng theo bảng sau:

• Mẫu bệnh nhân có đủ 8 marker với kích thước phù hợp là mẫu nam bình thường (không có mất đoạn)
• Sự vắng mặt của các marker cho thấy sự mất đoạn gen tương ứng. Đánh giá tình trạng mất đoạn trên NST Y dựa vào bảng sau:

7.4. Báo cáo kết quả

• Hoàn thành biểu mẫu BM01-XP008
• Trả kết quả xét nghiệm theo quy trình “Trả kết quả xét nghiệm” (QTKT06).

8. Yếu tố ảnh hưởng

• Kiểm tra hạn sử dụng, điều kiện bảo quản của các dung dịch, hóa chất… trước khi sử dụng.
• Các nguyên nhân dẫn đến kết quả sai:
  • Mẫu máu có thể chứa các chất gây ức chế phản ứng PCR như heparin (> 0.15 mg/ml), hemoglobin (> 1 mg/ml), polysaccharides, chlorophylls, melanin…; các chất tạp nhiễm từ pha tách chiết DNA như SDS (> 0.01% w/v), phenol (> 0.2% w/v), ethanol (> 1%), proteinase K, guanidinium, và sodium acetate (> 5 mM); mẫu chứa nuclease, protease hoặc mẫu bị biến tính.

9. Kiểm soát chất lượng

• Bộ kit được kiểm soát chất lượng bằng:
  • Mẫu chứng dương: mẫu DNA thương mại (Agilent)
  • Mẫu chứng âm: 2μl nước cất
• Marker nội chứng: ZFXY là marker nội chứng xuất hiện trên cả mẫu nam giới và nữ giới; sY14 là marker nội chứng luôn xuất hiện trên mẫu nam giới
• Tần suất kiểm tra: kiểm tra mỗi lần thực hiện xét nghiệm

10. Xử lý mẫu và chất thải

• Mẫu sau khi thực hiện xét nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ -80ºC trong 3 năm.
• Tuân thủ quy trình xử lý chất thải y tế.
• Tiến hành vệ sinh các thiết bị và bề mặt xét nghiệm bằng cồn 70º

11. Biểu mẫu

Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi xét nghiệm BM01-XP008

Xác định mất đoạn nhỏ (AZF) trên NST Y (QF-PCR)

Từ viết tắt:

• HHPƯ: Hỗn hợp phản ứng

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0