Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xác định kháng nguyên bạch cầu người B*27

Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

•  Hướng dẫn cho nhân viên phòng thí nghiệm thực hiện quy trình xác định kháng nguyên bạch cầu người HLA-B*27 bằng phương pháp Real-time PCR theo bộ sinh phẩm B27-RT50 HLAB27 Detection Kit.  

• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện.

2. Nguyên lý  

• Thực hiện phản ứng Real-time PCR với các mồi đặc hiệu allelle (Allele specific primers). Khi có sự xuất hiện của các allele mục tiêu các đường cong khuếch đại realtime sẽ được xây dựng. Sau đó việc xác định kiểu gene đột biến được thực hiện bằng phân tích đường cong nóng chảy dựa vào đặc tính phân ly của đoạn ADN mạch đôi trong quá trình gia nhiệt (Tm). B27-RT50 HLA-B27 Detection Kit là bộ sinh phẩm có kèm theo nội chứng IC, kiểm chứng cho sự có mặt của vật liệu di truyền trong mẫu. 

3. Định Nghĩa và khái niệm liên quan  

• HLA (Human Leukoctye antigen): Kháng nguyên bạch cầu người HLA-B*27 là kháng nguyên bề mặt MHC lớp I được mã hóa bởi các locus B trên nhiễm sắc thể số 6.  PCR (Polymerase chain reaction): Phản ứng chuỗi trùng ngưng ADN là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi để tạo ra nhiều bản sao của một đoạn ADN đặc hiệu. Thông qua phản ứng chuỗi trùng ngưng ADN, những bản sao của một trình tự ADN cụ thể sẽ được nhân lên theo cấp số mũ để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn ADN đó. 

4. Thiết bị/ vật tư tiêu hao/ Hóa chất 

4.1. Hóa chất

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Thiết bị

5. An toàn  

Các yêu cầu về an toàn phòng xét nghiệm được đề cập tại mục 5 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu (1 cặp mồi) 

6. Quy trình thực hiện 

6.1. Loại mẫu  

• 2 ml máu ngoại vi chống đông EDTA, bảo quản 2 – 8ºC

6.2. Tiếp nhận mẫu  

• thực hiện các bước như đã đề cập trong mục “6.2. Tiếp nhận mẫu” của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau” 

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình  

• Ghi Biểu mẫu theo dõi thực hiện xét nghiệm, lưu bản mềm trên máy tính, ổ chung của Khối. 

6.4. Các bước tiến hành 

• Bước tách DNA và tiêu chuẩn đạt của mẫu sau tách chiết được đề cập cụ thể tại mục 6.3 của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau”  
• Thực hiện phản ứng PCR 
  • Giữ lạnh các thành phần Realtime – PCR và ADN khuôn. Các bước trước chu trình nhiệt PCR cần được thực hiện trên khay đá lạnh (0 – 4°C). 
  • Lập biểu mẫu “ Quy trình xác định kháng nguyên bạch cầu người B*27 (HLA-B*27)” BM01 – XP020. 
  • Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (HHPƯ) (tại phòng pha mix) 
  • Rã đông các thành phần bộ sinh phẩm B27-RT50 HLA-B27 Detection Kit. 
  • Khi hóa chất đã tan đông hoàn toàn, Voltex và Ly tâm nhanh các ống ADN Taq Polymerase và PCR Mix. Sau đó, giữ các ống trên khay lạnh. 
  • Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (bao gồm Primer mix và HLA-B27 Master Mix) vào trong 1 ống tube PCR. Thành phần phản ứng như sau:

• Chuẩn bị số lượng các ống phản ứng PCR 0,2 ml và nắp real-time PCR 0,2 ml phù hợp với số lượng mẫu. Ghi mã số mẫu trên thân tuýp. Đặt các tuýp PCR trên khay lạnh
  • n = số mẫu bệnh phẩm + 1 mẫu chứng dương + 1 mẫu chứng âm 
• Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ, ly tâm nhanh. 
• Chuẩn bị 01 tuýp 0,5 ml để pha HHPƯ. 
• Tra các thành phần phản ứng theo thể tích đã tính vào ống HHPƯ. 
• Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ, ly tâm nhanh. 
• Chia đều 17 µl HHPƯ vào từng tuýp PCR được đặt trên giá lạnh. 
• Đặt các tuýp PCR lên giá và chuyển sang phòng tra mẫu. 
• Chuẩn bị khuôn ADN oThực hiện tra khuôn ADN trong tủ PCR Cabinet (dành để thao tác với mẫu ADN đã tách chiết) 
• Chuẩn bị các mẫu ADN đã tách chiết, mẫu chứng dương và âm, trộn đều và ly tâm nhanh 
• Kiểm tra các mẫu ADN đã được sắp xếp theo thứ tự phù hợp. 
• Pha loãng ADN khuôn về nồng độ 30 – 50 ng/μl (nếu cần). 
• Tra 3 µl ADN của từng mẫu và chứng vào các tuýp Real-time PCR tương ứng chứa HHPƯ, mix bằng pipet 3 lần. 
• Ly tâm nhanh các thanh phản ứng real-time PCR.  
• Thực hiện phản ứng real-time PCR (tại phòng PCR) 
  • Bật máy Real-time ABI 7500, bật máy tính và khởi động phần mềm 7500 Software v2.0.6. 
  • Lựa chọn chương trình Real-time PCR cho lần chạy mới. 
  • Trên giao diện phần mềm 7500 Software v2.0.6 kích vào ô Template. Cửa sổ Open xuất hiện, chọn file chạy Genmark_HLA-B27.edt đã được cài đặt trên máy. 
  • Lập file thông tin lần xét nghiệm 
  • Cửa sổ file Genmark HLA-B27.edt xuất hiện, kích vào mục Save trên thanh công cụ và chọn Save as, sau đó đặt tên cho file: LIDddmmyy (LID: Laboratory Sample ID và ddmmyy là ngày/tháng/năm thực hiện xét nghiệm) dạng file là (.eds). 
  • Khai báo thông tin mẫu và vị trí giếng mẫu tương ứng với vị trí đặt các thanh phản ứng trên máy Real-time. 
  • Đặt các thanh real-time PCR vào máy Real-time 7500. 
  • Kiểm tra tổng thể tích phản ứng là 20 µl. 
  • Kiểm tra chương trình nhiệt đã được cài đặt trên file. 
  • Chọn “None” trong phần quencher. 
  • HLA-B27= EvaGreen 
  • Click Start để bắt đầu chương trình nhiệt phản ứng Real-time PCR

6.5. Phân tích và báo cáo kết quả  

• Phân tích kết quả Kết quả lần xét nghiệm được chấp nhận khi: 
  • Chứng âm: Trên đồ thị Melt Curve dạng Delta Rn – Temperature không xuất hiện peak tín hiệu của nội chứng IC tại nhiệt độ 76°C và HLA B27 tại nhiệt độ 87,5°C. 
  • Chứng dương: Trên đồ thị Melt Curve dạng Delta Rn – Temperature xuất hiện peak tín hiệu của nội chứng IC tại nhiệt độ 76°C và HLA B27 tại nhiệt độ 87,5°C

• Báo cáo kết quả 
  • Kết quả được phân tích dựa trên phần mềm hiển thị đồ thị Melt Curve
  • ADN HLA B27 được phát hiện tại nhiệt độ 87,5°C và IC tại nhiệt độ 76°C

Hình 1. Kết quả Real-time HLA-B*27 Dương tính của chứng dương 

Hình 2. Kết quả Real-time HLA-B*27 Dương tính của mẫu bệnh phẩm

Hình 3. Kết quả Real-time HLA-B*27 của chứng âm

Bảng 1. Nhận định kết quả

• Kết quả phân tích cần được xem xét lại bởi phụ trách Khối Di truyền y học hoặc người được phân công để có kết quả thống nhất. Người xem xét ký xác nhận xem xét kết quả trên biểu mẫu “Xác định HLA-B27” (BM01-XP-020). 
• Sau khi Phụ trách đã xem xét và phê duyệt hồ sơ xét nghiệm và kết quả xét nghiệm, người thực hiện xét nghiệm chịu trách nhiệm lập phiếu trả kết quả xét nghiệm và công bố kết quả xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật “Quy trình trả kết quả xét nghiệm” (QTKT06).

7. Kiểm soát chất lượng  

Bộ kit được kiểm soát chất lượng bằng: 

• Chứng dương: mẫu Pos C+ bộ Kit cung cấp bản chất là ADN người có kiểu gen HLA-B27. Chứng dương được sử dụng để kiểm soát chất lượng cho phản ứng Real-time PCR  
• Chứng âm: ống dH2O bộ Kit cung cấp được sử dụng nhằm kiểm soát sự nhiễm chéo khi thực hiện phản ứng. 
• Nội chứng IC, kiểm chứng cho sự có mặt của vật liệu di truyền và chất lượng của các thành phần phản ứng.  
• Tần suất kiểm tra: kiểm tra mỗi lần thực hiện xét nghiệm

8. Xử lý mẫu và chất thải  

• Đã được đề cập ở mục 8 của ‘ Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu – 1 cặp mồi” . 

9. Biểu mẫu/ bảng kiểm/ phụ lục  

• Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi xét nghiệm: BM01: XP-020

• Phụ lục 2: Phiếu trả kết quả xét nghiệm: BM02: XP-020

• Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện quy trình xác định Human Leukocyte Antigen B*27  

• Phụ lục 4: Bảng kiểm thực hiện quy trình xác định Human Leukocyte Antigen B*27

Tài liệu liên quan  

• Quy trình tiếp nhận yêu cầu xét nghiệm  
• Quy trình kỹ thuật “Tách chiết DNA tổng số”  
• Quy trình báo cáo kết quả xét nghiệm  
• Quy trình kỹ thuật “Duy trì cơ sở vật chất và điều kiện môi trường” 

Tài liệu tham khảo 

• QIAamp DNA blood mini kit protocol, QIAGEN.  
• B27- RT50 HLA-B27 Detection Kit Manual Guideline.  
• Tài liệu hướng dẫn sử dụng máy Real time PCR của hãng ABI  
• Tài liệu về HLA-B27: The ramifications of HLA-B27, Journal of the Royal society of Medicine

Từ viết tắt:  

• HLA: Human Leukocyte Antigen 
• DNA: Deoxyribonucleic Acid  
• PCR: Polymerase Chain Reaction  
• HHPƯ: Hỗn hợp phản ứng  
• DTYH: Di truyền Y học 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0