MỚI

Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (Sequencing)

Ngày xuất bản: 29/06/2022

Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (Sequencing) áp dụng cho Trung tâm công nghệ cao Vinmec 

Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

  • Tài liệu này hướng dẫn thực hiện quy trình xét nghiệm xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (rối loạn phát triển thần kinh) bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen exon 2, exon 3, exon 4 mã hóa cho protein MECP2 theo phương pháp nội bộ.  
  • Đảm bảo nhân viên thực hiện xét nghiệm được đào tạo thực hiện đúng quy trình.

2. Nguyên lý  

  • Hội chứng Rett (RTT) là hội chứng rối loạn phát triển thần kinh trầm trọng ở trẻ em, đặc trưng bởi thời kỳ phát triển thần kinh bình thường ở trẻ trong giai đoạn từ 6 đến 18 tháng, sau đó bắt đầu sự suy thoái về kỹ năng vận động và ngôn ngữ kết hợp với các cử động rập khuôn ở tay.  
  • Hội chứng RTT xảy ra chủ yếu là do đột biến gen de novo (đột biến mới phát sinh trong quá trình phát triển bào thai) trên gen MECP2 (methyl-CpG-binding protein 2).  
  • Phương pháp xác định đột biến ở vùng mã hóa của exon 2, 3 và 4 của gen MECP2 bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger theo phương pháp in-house.  
  • Quy trình xét nghiệm gồm các bước sau: 
    • Nhân bản 3 đoạn gen vùng mã hóa của exon 2, 3 và 4 của gen MECP2 
    • Điện di trên thạch agarose 1% để kiểm tra sản phẩm PCR 
    • Giải trình tự gen trên hệ thống giải trình tự Sanger 3500Dx. 
    • Sử dụng phần mềm sinh học để xem trình tự nucleotide của đoạn gen và xác định đột biến.

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan  

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất 

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất 

Tên hoá chất /kitCat. Number/HãngĐiều kiện bảo quản
QIAamp DNA Blood Mini KitQIAGEN,(Cat No./ID: 51104) Nhiệt độ phòng 
GoTaq Green Master Mix 2XPromega, (REF: M712C) -20𝇈C
Nước thương mại không chứa nuclease Omega4𝇈C
Mồi (IDT) (nồng độ 10 µM) 10 mồi:  MECP2F, MECP2R MECP3F, MECP3R MECP4.1F, MECP4.1R MECP4.2F, MECP4.2R MECP4.3F, MECP4.3IDT-20𝇈C 
Bột AgaroseREF (V3125)Nhiệt độ phòng
Đệm TBE 10XInvitrogen (REF: 15581-044)Nhiệt độ phòng
Thang chuẩn DNA 1kb Invitrogen: (REF: 10787018)4𝇈C
Thuốc nhuộm Redsafe TM Nucleic Acid Staining Solution 20000XREF: 21141 4𝇈C
Nước cất hai lần Nhiệt độ phòng
BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingApplied Biosystem (REF: 4336915)4𝇈C
BigDye X Terminator purificationApplied Biosystem (REF: 4376486) 4𝇈C
POP-7 Polymer Applied Biosystem (REF: 4393709) 4𝇈C
Cathode Buffer Container Applied Biosystem (REF: 4408258) 4𝇈C
Anode Buffer ContainerApplied Biosystem (REF: 4393925) 4𝇈C
Hi-DiTM FormamideApplied Biosystem (REF: 4311320) -20𝇈C
Ethanol 70 %Công ty cổ phần Hóa dược Việt NamNhiệt độ phòng

5. An toàn  

Các yêu cầu về an toàn phòng xét nghiệm được đề cập tại mục 5 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu (1 cặp mồi)

6. Quy trình thực hiện xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (Sequencing)

6.1. Loại mẫu  

  • 2ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông bằng EDTA, bảo quản ở 4𝇈C.

6.2. Tiếp nhận mẫu  

xác định đột biến gen MECP2
Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (Sequencing)

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (Sequencing)

  • Lập biểu mẫu “Giải trình tự gen MECP2” (BM01-XP-013), lưu bản mềm trên máy tính, ổ lưu dữ liệu chung của của Khối Di truyền Y học (DTYH).  
  • Rã đông hoàn toàn các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng. 

6.4. Các bước tiến hành xác định đột biến gen MECP2 gây hội chứng RETT (Sequencing)

 Exon 2Exon 3Exon 4.1Exon 4.2Exon 4.3

Tên mồi 

F1E2  R1E2F1E3  R1E3F1E4.1  R1E4.1F1E4.2 R1E4.2F1E4.3  R1E4.3
  • Rã đông hoàn toàn các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng.
TTThành phầnNồng độ cuối cùngThể tích (μl)
Cho 1 phản ứng E2  n = E3  n =E4.1  n = E4.2  n =E4.3  n = 
1dH20  8,5      
2GoTaq Green Master Mix 2X1X12,5     
3Mồi F (10μM)0,4 μM1,0      
4Mồi R (10μM) 0,4 μM1,0      
 Tổng thể tích  23,0     
  • Tính toán thể tích của từng thành phần phản ứng cho mỗi loại phản ứng PCR 
  • Trộn đều tuýp mồi và tuýp GoTaq 2X, ly tâm nhanh các ống. 
  • Chuẩn bị số lượng ống PCR 0.2 ml phù hợp với số lượng mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm. Ghi mã số mẫu lên nắp và đặt ống trên khay lạnh. 
  • Chuẩn bị tuýp 1.5 ml để pha HHPƯ. 
  • Tra các thành phần phản ứng theo thể tích đã tính vào HHPƯ 
  • Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ, ly tâm nhanh. 
  • Chia đều 23 µl HHPƯ vào từng tuýp PCR được đặt trên giá lạnh. 
  • Đặt các tuýp PCR lên giá đỡ và chuyển sang phòng tra mẫu  
  •  
  • Tra mẫu DNA vào HHPƯ (tại phòng PCR) 
    • Thực hiện tra khuôn DNA trong tủ PCR Cabinet (thao tác với mẫu DNA đã tách chiết) 
    • Chuẩn bị các mẫu DNA đã tách chiết. 
    • Khởi động máy PCR ít nhất 5 phút trước khi thực hiện chương trình nhiệt. 
    • Trộn đều và ly tâm nhanh các ống chứa mẫu đã được chuẩn bị trước.  
    • Kiểm tra các mẫu DNA đã được sắp xếp theo thứ tự phù hợp. 
    • Tra 2 µl DNA mẫu (nồng độ 20-125 ng/µl) vào các tuýp PCR tương ứng chứa HHPƯ, mix bằng pipet 3 lần. 
    • Ly tâm nhanh các tuýp PC
  • Thực hiện phản ứng PCR (tại phòng PCR) 
    • Đặt các tuýp PCR vào máy PCR tương ứng 
    • Lựa chọn chương trình nhiệt PCR đã được cài đặt trên máy. Kiểm tra tổng thể tích phản ứng là 25 µl. Kiểm tra kỹ chương trình trên máy, tên chu trình chạy so với chu trình yêu cầu cần chạy trên Phiếu theo dõi thực hiện xét nghiệm.

  • Kết thúc phản ứng PCR, bảo quản sản phẩm PCR tại tủ lạnh lưu mẫu -20𝇈C. 
  • Điện di sản phẩm PCR (tại phòng điện di) 
    • Điện di sản phẩm PCR theo hướng dẫn quy trình kĩ thuật “Điện di sản phẩm PCR” (QTKT04) với các điều kiện điện di:  
      • Hiệu điện thế: 100 V.  
      • Thời gian: 30 phút. 
  • Sử dụng gel agarose 1% và thang chuẩn DNA 1 kb. 
  • Tra 5 µl thang chuẩn DNA (nồng độ 0.1 µg/µl) và 5µl sản phẩm PCR vào từng giếng. 
  • Đánh giá kết quả điện di sản phẩm PCR và xác định các mẫu có băng sản phẩm đặc hiệu để tinh sạch và pha loãng. Chứng âm giếng Negative Control (NC) không có băng sản phẩm PCR.
 Exon 2Exon 3Exon 4.1Exon 4.2Exon 4.3
Kích thước (bp)  355484429631388

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR MECP2 (E2, E3, E4.1, E4.2, E4.3)

  • Tinh sạch sản phẩm bằng phương pháp pha loãng sản phẩm PCR 
    • Lượng DNA cần thiết cho phản ứng Cycle Sequencing (thể tích 10 µl), sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing là 05 – 20 ng. 
    • Xác định hệ số pha loãng mẫu để có lượng DNA phù hợp cho vào phản ứng Cycle Sequencing. 
    • Xác định nồng độ DNA tương đối bằng cách so sánh độ sáng của băng điện di sản phẩm PCR đặc hiệu với vạch có kích thước tương ứng trong thang chuẩn DNA. 
    • Thực hiện pha loãng sản phẩm PCR đã tinh sạch trong tủ thao tác PCR (PCR cabinet) (tủ dành thao tác sản phẩm PCR) trong phòng PCR. 
    • Chuẩn bị số lượng ống 1.5 ml phù hợp. Ghi rõ mã số mẫu và tỉ lệ pha loãng trên các ống. Đặt các ống trên khay lạnh theo thứ tự cần pha loãng. 
    • Đặt các tuýp chứa sản phẩm PCR đã tinh sạch trên khay theo thứ tự tương ứng. 
    • Tra nước thương mại không chứa nuclease vào ống 1,5 ml với thể tích đã tính toán 
    • Tra sản phẩm PCR đã tinh sạch vào ống 1,5 ml để có nồng độ DNA cần thiết. 
    • Hút pipet lên xuống 3 lần và mix nhẹ bằng tay để đồng nhất hỗn hợp. Sau đó ly tâm nhanh. 
    • Bảo quản sản phẩm PCR gốc (chưa pha loãng) tại tủ -20𝇈C.  
  • Thực hiện phản ứng cycle sequencing 
    • Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng (HHPƯ) cho Cycle Sequencing (phòng Pre-PCR): 
    • Rã đông các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng:  
      • Mồi (nồng độ 10 µM) sử dụng 4 mồi đã dùng thực hiện phản ứng PCR.  
      • ước thương mại không có nuclease.  
      • 5X Big Dye Buffer (từ tủ 4oC).  
      • Lưu ý: Lấy ống Big Dye v3.1 Reaction Mix từ tủ -20oC và giữ trên khay lạnh.
  • Chuẩn bị số lượng thanh 8 tuýp 0.2 ml phù hợp với số lượng mẫu. Ghi mã số mẫu trên thanh phản ứng và ghi vị trí tuýp ương ứng với biểu mẫu trên từng tuýp 0.2 ml. 
  • Chuẩn bị 1 tuýp 1.5 ml để pha HHPƯ. 
  • Dùng máy lắc để trộn đều ống mồi, ống 5X Big Dye Buffer. Ly tâm nhanh các ống. 
  • Pha HHPƯ cho Cycle sequencing:
Thành phần phản ứngThể tích (μl)x ( )
Hỗn hợp phản ứngBigDye Terminator0.5 
5x Sequencing Buffer2 
dH2O4.65 
Mồi đơn (10 M) 0.85 
Thể tích hỗn hợp/phản ứng8
Thể tích sản phẩm PCR đã tinh sạch2
Tổng thể tích phản ứng10
  • Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ. 
  • Chia HHPƯ vào từng tuýp 0.2 ml của thanh phản ứng với thể tích 8 µl/tuýp. 
  • Đặt thanh 8 tuýp chứa HHPƯ lên giá và chuyển sang phòng PCR.  
  • Tra sản phẩm PCR đã pha loãng vào HHPƯ (phòng PCR) 
    • Đặt các thanh phản ứng trên khay lạnh. 
    • Khởi động máy PCR ít nhất 5 phút trước khi thực hiện chương trình nhiệt. 
    • Trộn đều và ly tâm nhanh các ống chứa sản phẩm PCR đã được chuẩn bị cho phản ứng Cycle Sequencing. 
    • Sắp xếp các ống chứa mẫu theo thứ tự phù hợp. 
    • Tra 2 µl sản phẩm PCR đã tinh sạch vào các tuýp 0.2 ml chứa HHPƯ Cycle Sequencing tương ứng. 
    • Hút pipet lên xuống 3 lần để đồng nhất hỗn hợp. Ly tâm nhanh các thanh phản ứng. 
    • Đặt các thanh phản ứng vào máy PCR. 
    • Lựa chọn chương trình nhiệt “Sequencing” đã được cài đặt trên máy. Kiểm tra tổng thể tích phản ứng

  • Tinh sạch sản phẩm Cycle sequencing bằng sinh phẩm Bigdye X Terminator purification kit 
    • Sau khi kết thúc phản ứng Cycle sequencing, ly tâm nhanh các tube phản ứng. 
    • Lấy bộ sinh phẩm tinh sạch Bigdye X Terminator purification từ tủ lạnh 4oC ra ngoài ngay trước khi sử dụng. 
    • Lắc đều lọ dung dịch SAM solution, vortex tube BigDye X-Terminator trong ít nhất 10 giây. 
    • Tra vào mỗi giếng phản ứng các thành phần như bảng sau: 
Thành phầnThể tích (μl)
SAM solution45
BigDye X-Terminator10
Mẫu cần tinh sạch10
  • Đóng chặt nắp tube và vortex 30 phút sau đó ly tâm 1000g trong 2 phút. 
  • Nếu chưa thực điện di mao quản ngay, có thể bảo quản mẫu trong tủ lạnh lưu mẫu – 20oC.
  • Giải trình tự bằng phương pháp điện di mao quản trên máy ABI 3500 
    • Khởi động máy điện di mao quản 3500 (ABI) ít nhất 15 phút trước khi chạy điện di. 
    • Thực hiện điện di mao quản theo hướng dẫn: 
    • Kiểm tra tình trạng sinh phẩm điện di mao quản: trên màn hình chính (Dashboard) của phần mềm, kiểm tra các thông số đo của Polymer, Anode buffer, Cathode buffer và mao quản. 
    • Đảm bảo rằng:  
      • Sinh phẩm chưa hết hạn.  
      • Lượng sinh phẩm còn lại đủ để thực hiện điện di mao quản. 
  • Cài đặt nhiệt độ chạy máy, chọn Start Pre-heat. 
  • Kiểm tra bọt khí bên trong hệ thống bơm. Nếu có bọt khí, thực hiện đuổi bọt khí theo chương trình Remove Bubble winzard và làm theo hướng dẫn. 
  • Ấn nút “Tray” để lấy đĩa 96 giếng Micro Amp từ máy 3500 ra. 
  • Xác định vị trí giếng cần tra và điền thông tin vị trí giếng vào biểu mẫu (BM01-XP013). 
  • Khai báo thông tin lần chạy: 
  • Trên màn hình chính (Dashboard), chọn Create new plate. 
  • Hộp thoại Template xuất hiện, lựa chọn:  
    • Number of well: 96  
    • Plate type: Sequencing  
    • Capillary Length: 50 cm  
    • Polymer: POP7 
    • Sample names and sample types: Khai báo vị trí mẫu, tên mẫu  
    • Assay: lựa chọn chương trình chạy Fast_Seq_Asay-POP7  
    • Filename convention: lựa chọn định dạng tên file kết quả phù hợp  
    • Results group: lựa chọn folder lưu kết quả
  • Tra 15 µl dịch nổi đã tinh sạch vào các giếng trên đĩa 96 giếng Micro Amp theo đúng vị trí đã nêu trong biểu mẫu (BM01-XP013). 
  • Đặt tấm phản ứng vào vị trí khay mẫu trên máy ABI 3500Dx. 
  • Chọn Link plate for run. 
  • Chọn Start run.  
  • Các kết quả trung gian được sử dụng 
    • Kết quả 1 được sử dụng cho bước điện di sản phẩm PCR. 
    • Kết quả 2 là hình ảnh kết quả giải trình tự gen. 
    • Các kết quả ghi chép đầy đủ vào biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen MECP2 (Sequencing)” (BM01-XP-013).  
  • Phân tích và báo cáo kết quả: Phân tích kết quả 
    • Kết quả điện di mao quản được thu thập trên máy tính kết nối với máy ABI 3500. Chuyển dữ liệu bằng đĩa nội bộ (không dùng USB) sang máy tính phân tích dữ liệu và xử lý kết quả bằng phần mềm Chromas
    • Sử dụng phần mềm phân tích trình tự Chromas Pro hoặc GeneStudio để tổng hợp trình tự nucleotide thu được từ các mồi riêng biệt thành trình tự gen hoàn chỉnh. 
    • Trình tự tổng hợp cần được khẳng định dựa trên dữ liệu từ tối thiểu từ 2 trình tự riêng biệt. 
    • Trình tự nucleotide tổng hợp cần được kiểm tra lại bởi một nhân viên khác để có kết quả thống nhất. 
    • Lưu trình tự gen đã tổng hợp dưới dạng file: FASTA 
    • Phân tích dữ liệu trình tự thu được so sánh với trình tự nucleotide và axit amin tham khảo của ngân hàng Gene Bank mã (NG_007107.2) trên trang web https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
    • Mở file Word mới, và copy toàn bộ dữ liệu so sánh trình tự nucleotide thu thập được từ trang web. Điền thông tin tên bệnh nhân, mã mẫu bệnh phẩm và lưu file dữ liệu dưới tên file: Mã mẫu bệnh phẩm-Tên bệnh nhân. Dựa trên file word này xác định các thông tin:  
      • Xác định và đánh dấu vị trí các điểm biến đổi khác với trình tự nucleotide tham khảo.  
      • Xác định và đánh dấu các exon 2, exon 3, exon 4, xác định điểm biến đổi, tương ứng vị trí mã codon 
  • Tham khảo trang web phân loại đột biến MECP2 liên quan đến hội chứng RETT http://mecp2.chw.edu.au/cgi-bin/mecp2/views/basic.cgi?form=basic để tham khảo mức độ ảnh hưởng của điểm biến đổi/đột biến đã được đánh giá, tổng hợp. 
  • Xuất file ảnh chụp trình tự tại vị trí đột biến và lưu vào tệp lưu trữ kết quả xét nghiệm trong ổ T. Ghi lại kết quả tình trạng đột biến của bệnh nhân vào biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen MECP2 (sequencing)” (BM01-XP-013).  
  • Phê duyệt và báo cáo kết quả 
    • Trình bộ kết quả sau cho phụ trách Khối Di truyền Y học hoặc người được phân công đánh giá và xác nhận kết quả:  
      • Biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen MECP2 (sequencing)” (BM01-XP013).  
      • File in bản word so sánh trình tự nucleotide của mẫu bệnh nhân và trình tự tham khảo Gene bank (NG_007107.2) đã được xác định các điểm biến đổi. Phụ trách ký xác nhận kết quả.  
      • File dữ liệu trình tự sóng giải trình tự AB1 file của từng mồi và file tổng hợp trình tự nucleotide đã được đọc.  
      • Bản tổng hợp ảnh chụp trình tự tại các vị trí đột biến, chỉ rõ vị trí đột biến cần khảo sát. 
  • Sau khi Phụ trách đã xem xét và phê duyệt hồ sơ xét nghiệm và kết quả xét nghiệm, người thực hiện xét nghiệm chịu trách nhiệm lập phiếu trả kết quả xét nghiệm và công bố kết quả xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật “Quy trình trả kết quả xét nghiệm” (QTKT06). 

7. Kiểm soát chất lượng 

Đã được đề cập ở mục 7 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu – 1 cặp mồi” 

8. Xử lý mẫu và chất thải 

Đã được đề cập ở mục 8 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu – 1 cặp mồi”

9. Phụ lục/bảng kiểm/biểu mẫu  

  • Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện quy trình giải trình tự gen MECP2 gây hội chứng Rett (Sequencing)

Tài liệu liên quan  

  • Các SOPs vận hành trang thiết bị sử dụng trong quy trình này 
    • Quy trình kỹ thuật “Điện di sản phẩm PCR” 
    • Quy trình kỹ thuật “Quy trình điện di mao quản sản phẩm Cycle Sequencing” 
  • Các SOPs hướng dẫn các quy trình liên quan 
    • Quy trình tiếp nhận yêu cầu xét nghiệm 
    • Quy trình kỹ thuật “Tách chiết DNA tổng số (Qiagen)” 
    • Quy trình kỹ thuật “Điện di sản phẩm PCR” 
    • Quy trình kỹ thuật “Quy trình điện di mao quản sản phẩm Cycle Sequencing” 
    • Quy trình kỹ thuật “Trả kết quả xét nghiệm” 
    • Quy trình kỹ thuật “Duy trì cơ sở vật chất và điều kiện môi trường” 
    • Biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen MECP2 (Sequencing)” (BM01-XP-013) 

Tài liệu tham khảo 

  • QIAamp DNA Mini Blood Mini Handbook, QIAGEN. 
  • Hướng dẫn sử dụng GoTaq Green Master Mix, Promega. 
  • Hướng dẫn sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing, ABI. 
  • Hướng dẫn sử dụng BigDye XTerminator Purification Kit (ABI). 
  • Hướng dẫn sử dụng máy 3500Dx (ABI) 

Từ viết tắt:  

  • DNA: Deoxyribonucleic Acid  
  • PCR: Polymerase Chain Reaction  
  • HHPƯ: Hỗn hợp phản ứng  
  • DTYH: Di truyền Y học

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

facebook
1

Bài viết liên quan

Bình luận0

Đăng ký
Thông báo về
guest
0 Comments
Inline Feedbacks
Xem tất cả bình luận

Bài viết cùng chuyên gia