Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích

Hướng dẫn cho nhân viên phòng thí nghiệm thực hiện quy trình xác định đột biến gen KRAS bằng bộ sinh phẩm KRAS XL StripAssay ® (Vienna Lab, Ref 5-680) và đột biến gen BRAF bằng bộ sinh phẩm BRAF 600/601 StripAssay ® (Vienna Lab, Ref 5-560). Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện.

2. Nguyên lý

Stripassay là một phương pháp phát hiện đột biến bằng cách kết hợp 3 kỹ thuật là phản ứng nhân bản PCR phản ứng lai bổ sung, và phản ứng quang hóa. Một cách ngắn gọn, quy trình gồm ba bước chính: (1) nhân đoạn DNA mong muốn bằng mồi có gắn biotin, (2) lai DNA có gắn biotin với những đoạn oligonucleotide đặc hiệu được gắn trên thanh lai, (3) phát hiện những đoạn DNA có gắn biotin trên thanh lại bằng phản quang hóa.

3. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

• Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó.
• Phản ứng lai theo nguyên tắc bổ sung là một kỹ thuật sử dụng nguyên tắc bắt cặp bổ sung.
• Phản ứng này cho phep hai sợi axit nucleic đơn có thể bắt cặp với nhau nếu trình tự bổ sung của chúng đủ tương đồng với nhau. Kỹ thuật này cho phép phát hiện những trình tự đặc hiệu hoặc có thể sử dụng để đánh giá mức độ tương đồng của trình tự.
• Phản ứng quang hóa là một phương pháp phát hiện dựa trên sự phát quang của một phản ứng hóa học được xúc tác bởi enzyme.

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất xác định đột biến gen Kras và Braf 

4.1. Thiết bị

• Các thiết bị cần thiết để thực hiện xét nghiệm này được đề cập trong mục 4.1 “Quy trình xét nghiệm phát hiện đột biến gen Alpha globin bằng kỹ thuật Stripassay Vienna lab”

4.2. Vật tư tiêu hao

• Các thiết bị cần thiết để thực hiện xét nghiệm này được đề cập trong mục 4.2 “Quy trình xét nghiệm phát hiện đột biến gen Alpha globin bằng kỹ thuật Stripassay Vienna lab”

4.3. Hóa chất

5. An toàn

• Các yêu cầu về an toàn phòng xét nghiệm được đề cập tại mục 5 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu (1 cặp mồi)

6. Quy trình kỹ thuật thực hiện

6.1. Loại mẫu

• Khối u đúc trong khối nến.

6.2. Tiếp nhận mẫu

• Mẫu được nhận từ khoa xét nghiệm, bệnh viện Vinmec Time City. Nhân viên thực hiện xét nghiệm ghi nhãn LID, điền thông tin vào sổ theo dõi dịch vụ xét nghiệm, mã số VNCV5.4-QL01BM01.

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình

• Ghi Biểu mẫu theo dõi thực hiện xét nghiệm, lưu bản mềm trên máy tính, ổ chung của Khối.

6.4. Các bước tiến hành

6.4.1. Tách DNA

• DNA từ mẫu khối nến được tách theo quy trình SOP-DCR-001.

6.4.2. Khuếch đại DNA (PCR)

• Giữ hóa chất của phản ứng chuỗi trùng ngưng DNA và mẫu DNA trên đá lạnh trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm
• Pha loãng 1 μl Taq DNA Polymerase (red cap) trong 24 μl dung dịch pha loãng Tag (transparent cap) (1:25, final conc. 0.2 U/μl).
• Pha loãng mẫu DNA để có nồng độ từ 1-10 ng/ μl.
• Với mỗi mẫu chuẩn bị 02 phản ứng PCR gồm 01 phản ứng KRAS PCR và 01 phản ứng BRAF PCR. Thành phần mỗi phản ứng gồm 15 μl Amplification Mix, 5 μl Taq DNA polymerase (đã pha loãng) và 5 μl mẫu DNA trong một ống PCR.
• Đóng chặt nắp ống, vortex 15 giây, và ly tâm 30 giây.
• Đặt ống phản ứng PCR vào máy PCR proflex và chạy chương trình nhiệt như sau: 
  • Tiền PCR: 37°C/10 phút; 94°C/2 phút .
  • 35 chu kỳ: 94°C/1 phút. – 70°C/50 giây. – 56°C/50 giây, – 60°C/1 phút.
  • Tổng hợp cuối: 60°C/3 phút.
• Giữ sản phẩm PCR trên đá hoặc ở nhiệt độ từ 2-8°C.

6.4.3. Điện di (không bắt buộc)

• Điện di trên 3% agarose gel trong đệm TBE 0,5X.
• Tra hỗn hợp 5 μl sản phẩm PCR với 0.5 μl 10x loading dye vào một giềng.
• Tra 5 μl of 1 kb DNA ladder vào một giềng
• Điện di ở 100 V trong 30 phút.
• Chụp ảnh gel.

6.4.4. Phản ứng lai

• Chuẩn bị trước khi làm xét nghiệm:
  • Bể ổn nhiệt với mức nước bằng 1⁄2 chiều cao bể, nhiệt độ 45oC.
  • Đặt nhiệt độ bể ổn nhiệt ở 45oC.
  • Làm ấm Hybridization Buffer và Wash Solution A tới 45°C.
  • Cho phép Teststrips, DNAT, Conjugate Solution, Wash Solution B và Color Developer đạt nhiệt độ phòng.
  • Chuẩn bị khay lai. Lấy một thanh lai cho một mẫu bằng pank sạch. Đánh dấu thanh lai bên ngoài vạch đánh dấu bằng bút chì.
• Tra mỗi 10 μl DNAT (nắp xanh dương) vào 02 giếng lai: 01 giếng cho KRAS và 01 giếng cho BRAF.
• Tra 10 μl sản phẩm KRAS PCR vào vị trí giếng lai đánh dấu KRAS có chứa 10 μl DNAT. Trộn đều bằng pipet.
• Tra 10 μl sản phẩm BRAF PCR vào vị trí giếng lai đánh dấu BRAF có chứa 10 μl DNAT. Trộn đều bằng pipet.
• Để khay lai ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
• Thêm 1 ml Hybridization Buffer (đã được làm ấm đến 45oC) vào mỗi giếng, lắc khay nhẹ nhàng cho đến khi màu xanh biến mất.
• Đặt Teststrip đã đánh dấu vào trong rãnh có sản phẩm PCR tương ứng sao cho mặt có marker (mặt nhám) ở bên trên, toàn bộ TestStrip ngập trong dung dịch.
• Ủ hỗn hợp 30 phút ở 45oC trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.
• Sau khi ủ, loại bỏ dung dịch lai bằng pipet pasteur hoặc máy hút.
• Thêm 1 ml Wash Solution A (45oC) vào mỗi giếng, lắc nhẹ trong 10 giây.
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution A bằng pipet Pasteur hoặc máy hút.
• Thêm 1 mL Wash Solution A (45oC) vào mỗi giếng.
• Ủ 15 phút ở 45oC trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution A bằng pipet Pasteur hoặc máy hút.
• Thêm 1 mL Wash Solution A (45oC).
• Ủ 15 phút ở 45oC trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution A bằng pipet Pasteur hoặc máy hút
• Thêm 1 mL Conjugate Solution.
• Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng, trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.
• Loại bỏ dung dịch bằng pipet pasteur hoặc máy hút.
• Thêm 1 mL Wash Solution B, lắc nhẹ trong 10 giây.
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution B bằng pipet pasteur hoặc máy hút.
• Thêm 1 mL Wash Solution B.
• Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution B bằng pipet pasteur hoặc máy hút.
• Thêm 1 mL Wash Solution B.
• Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút.
• Loại bỏ dung dịch Wash Solution B bằng pipet pasteur hoặc máy hút,
• Thêm 1 mL Color Developer.
• Ủ 5-10 phút ở nhiệt độ phòng trong máy lắc ủ nhiệt, tốc độ 250 vòng/phút. Các vết màu tím sẽ xuất hiện nếu có phản ứng dương tính.
• Rửa thanh lai vài lần với nước cất. Để thanh lai khô trên giấy thấm
• Chú ý: không để teststrip tiếp xúc với ánh sáng mạnh trong khi phản ứng phát hiện màu.

6.4.5. Phân tích kết quả

• Dán Teststrip lên Collector Sheet, dóng 2 vạch đỏ và xanh tương ứng với mô tả.
• Testtrip sau khi dán lên Collecter Sheet có thể scan và đọc kết quả bằng phần mềm StripAssay Evaluator.
• Thiết kế của một thanh lai

Bảng 3: Nhận định kết quả xét nghiệm

• Kết quả dương tính (xuất hiện băng) ở vạch “Control” cho thấy hoạt tính tốt của Conjugate Solution và Color Developer.
• Kết quả dương tính đối với vạch PCR Positive Control cho biết: Hóa chất trong phản ứng PCR và mẫu DNA cho phân tích đột biến KRAS đạt tiêu chuẩn về số lượng và chất lượng. Nếu các vạch này cho kết quả âm tính, cần kiểm tra lại chất lượng DNA và thực hiện xét nghiệm lặp lại.
• Kết quả âm tính của vạch PCR Negative Control cho thấy dạng wild type bị ức chế hoàn toàn trong phản ứng PCR. Nếu PCR Negative Control có kết quả dương tính (có thể do nồng độ DNA đầu vào quá), thì độ nhạy của xét nghiệm đã bị ảnh hưởng.

7. Kiểm soát chất lượng

• Nồng độ DNA mẫu >/= 10 ng/ul; 260/280 = 1.8-2.0; 260/230 >/=2
• Kết quả điện di: có bang tương ứng 151, 153, 157, 204 bp.
• Có vạch ở dòng “control” trên thanh lai
• Có băng ở vạch “PCR positive control” trên thanh lai.
• Không có băng ở vạch “PCR negative control” trên thanh lai.

8. Xử lý mẫu và chất thải

• Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -80º
• Tuân thủ quy trình xử lý chất thải y tế
• Tiến hành vệ sinh các thiết bị và bề mặt xét nghiệm bằng cồn 70o

Phụ lục 1. Sơ đồ thực hiện quy trình

Xác định đột biến trên gen KRAS/BRAF bằng kỹ thuật StripAssay

Phụ lục 2: Bảng kiểm thực hiện quy trình xác định đột biến KRAS bằng kỹ thuật Stripassay Phụ lục 3: Biểu mẫu theo dõi thực hiện quy trình xác định đột biến KRAS bằng kỹ thuật Stripassay

Tài liệu tham khảo

• https://www.viennalab.com/products/cancer/kras_stripassay?showAll=1

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0