Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

• Tài liệu này hướng dẫn thực hiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 V617F bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification-Refractory Mutation System).  

• Đảm bảo nhân viên thực hiện xét nghiệm được đào tạo thực hiện đúng quy trình.

2. Nguyên lý  

• Phương pháp xác định đột biến gen JAK2 V617F bằng kỹ thuật ARMS PCR. Gen JAK2 nằm trên nhiễm sắc thể 9p24, có liên quan đến quá trình dẫn truyền tín hiệu của hệ thống tạo máu và miễn dịch. Đột biến trong gen JAK2 đã đóng vai trò là dấu hiệu bệnh cho bệnh u nguyên bào tủy.  

3. Định nghĩa và khái niệm liên quan  

• Phản ứng chuỗi trùng ngưng DNA là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi để tạo ra nhiều bản sao của một đoạn DNA đặc hiệu. Thông qua phản ứng chuỗi trùng ngưng DNA, những bản sao của một trình tự DNA cụ thể sẽ được nhân lên theo cấp số mũ để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn DNA đó.

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất 

5. An toàn  

Các yêu cầu về an toàn phòng xét nghiệm được đề cập tại mục 5 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu (1 cặp mồi) 

6. Quy trình thực hiện xác định đột biến gen JAK2 V617F

6.1. Loại mẫu  

• 2ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông bằng EDTA, bảo quản ở 4𝇈C

6.2. Tiếp nhận mẫu  

•  Thực hiện các bước như đã đề cập trong mục “6.2. Tiếp nhận mẫu” của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau” 

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình xác định đột biến gen JAK2 V617F

• Lập biểu mẫu “Xác định đột biến gen JAK2 V617F” (BM01-XP014), lưu bản mềm trên máy tính, ổ lưu dữ liệu chung của của Khối Di truyền Y học (DTYH).  
• Rã đông hoàn toàn các ống chứa thành phần phản ứng tại nhiệt độ phòng.  

6.4. Các bước tiến hành xác định đột biến gen JAK2 V617F

• Bước tách DNA và tiêu chuẩn đạt của mẫu sau tách chiết được đề cập cụ thể tại mục 6.3 của “Quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau”  
• Chuẩn bị Hỗn hợp phản ứng cho PCR (tại phòng pha mix) . 
  • Thực hiện 1 phản ứng PCR cho mỗi mẫu với các mồi JAK2-FWT, JAK2-RWT, JAK2- F, JAK2-R.

• Tính toán thể tích của từng thành phần phản ứng cho mỗi loại phản ứng PCR 
• Trộn đều tuýp mồi và tuýp GoTaq 2X, ly tâm nhanh các ống.  
• Chuẩn bị số lượng ống PCR 0.2 ml phù hợp với số lượng mẫu bệnh phẩm và mẫu chứng âm. Ghi mã số mẫu lên nắp và đặt ống trên khay lạnh.
• n = số mẫu bệnh phẩm + 1 mẫu chứng dương + 1 mẫu chứng âm + 1 mẫu nước không chứa DNA
• Chuẩn bị tuýp 1.5 ml để pha HHPƯ. 
• Tra các thành phần phản ứng theo thể tích đã tính vào HHPƯ 
• Đảo trộn nhẹ nhàng để đồng nhất HHPƯ, ly tâm nhanh. 
• Chia đều 23 µl HHPƯ vào từng tuýp PCR được đặt trên giá lạnh. 
• Đặt các tuýp PCR lên giá đỡ và chuyển sang phòng tra mẫu  
• Tra mẫu DNA vào HHPƯ (tại phòng PCR) 
  • Thực hiện tra khuôn DNA trong tủ PCR Cabinet (thao tác với mẫu DNA đã tách chiết) 
  • Chuẩn bị các mẫu DNA đã tách chiết. 
  • Khởi động máy PCR ít nhất 5 phút trước khi thực hiện chương trình nhiệt. 
  • Trộn đều và ly tâm nhanh các ống chứa mẫu đã được chuẩn bị trước.  
  • Kiểm tra các mẫu DNA đã được sắp xếp theo thứ tự phù hợp. 
  • Tra 2 µl DNA mẫu (nồng độ 20-125 ng/µl) vào các tuýp PCR tương ứng chứa HHPƯ, mix bằng pipet 3 lần. 
  • Ly tâm nhanh các tuýp PCR.  
• Thực hiện phản ứng PCR (tại phòng PCR) 
  • Đặt các tuýp PCR vào máy PCR tương ứng
  • Lựa chọn chương trình nhiệt PCR đã được cài đặt trên máy. Kiểm tra tổng thể tích phản ứng là 25 µl.

• • Kết thúc phản ứng PCR, bảo quản sản phẩm PCR tại tủ lạnh lưu mẫu -20𝇈C
• Điện di sản phẩm PCR (tại phòng điện di) 
  • Điện di sản phẩm PCR theo hướng dẫn quy trình kĩ thuật “Điện di sản phẩm PCR” (QTKT04) với các điều kiện điện di:  
    • Hiệu điện thế: 100 V.  
    • Thời gian: 45 phút. 
• Sử dụng gel agarose 2% và thang chuẩn DNA 1 kb. 
• Tra 5 µl thang chuẩn DNA (nồng độ 0.1 µg/µl) và 15µl sản phẩm PCR vào từng giếng. 
•  Đánh giá kết quả điện di sản phẩm PCR và xác định các mẫu có băng sản phẩm đặc hiệu để tinh sạch và pha loãng. Chứng âm giếng Blank Control (BC) không có băng sản phẩm PCR
• Các kết quả trung gian được sử dụng 
  • Kết quả 1 được sử dụng cho bước điện di sản phẩm PCR. 
  • Các kết quả ghi chép đầy đủ vào biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen JAK2 V617F” (BM01-XP014) 

6.5. Phân tích và báo cáo kết quả  P

• Phân tích kết quả 
  • Dựa vào số băng và kích thước của từng băng sản phẩm PCR để xác định có dương tính với đột biến hay không  

• Phê duyệt và báo cáo kết quả 
  • Trình bộ kết quả sau cho phụ trách Khối Di truyền Y học hoặc người được phân công đánh giá và xác nhận kết quả:  
    • Biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen JAK2 V617F” (BM01-XP014). 
    • Ảnh điện di sản phẩm PCR.

• Sau khi Phụ trách đã xem xét và phê duyệt hồ sơ xét nghiệm và kết quả xét nghiệm, người thực hiện xét nghiệm chịu trách nhiệm lập phiếu trả kết quả xét nghiệm và công bố kết quả xét nghiệm theo quy trình kỹ thuật “Quy trình trả kết quả xét nghiệm” (QTKT06). 

7. Kiểm soát chất lượng  

• Chứng dương là mẫu DNA của người Dương tính với đột biến V617F.  
• Chứng âm là mẫu DNA của người Âm tính với đột biến V617F.  
• Chứng không DNA là nước thương mại không chứa nuclease được sử dụng nhằm kiểm soát sự nhiễm chéo khi thực hiện phản ứng.

8. Xử lý mẫu và chất thải  

• Đã được đề cập ở mục 8 của “Quy trình giải trình tự đoạn gen theo yêu cầu – 1 cặp mồi”.

9. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục  

• Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi xét nghiệm: BM01: XP-014  

• Phụ lục 2: Phiếu trả kết quả xét nghiệm: BM02: XP-014  

• Phụ lục 3: Lưu đồ thực hiện quy trình xác định đột biến gen JAK2 V617F 

• Phụ lục 4: Bảng kiểm thực hiện quy trình

Tài liệu liên quan  

• Các SOPs vận hành trang thiết bị sử dụng trong quy trình này 
  • Quy trình kỹ thuật “Điện di sản phẩm PCR”  
• Các SOPs hướng dẫn các quy trình liên quan 
• • Quy trình tiếp nhận yêu cầu xét nghiệm 
  • Quy trình kỹ thuật “Tách chiết DNA tổng số (Qiagen)”  
  • Quy trình kỹ thuật “Điện di sản phẩm PCR” 
  • Quy trình kỹ thuật “Trả kết quả xét nghiệm” 
  • Quy trình kỹ thuật “Duy trì cơ sở vật chất và điều kiện môi trường” 
  • Biểu mẫu xét nghiệm “Xác định đột biến gen JAK2 V617F” (BM01-XP014)

Tài liệu tham khảo 

• QIAamp DNA Mini Blood Mini Handbook, QIAGEN. 
• Hướng dẫn sử dụng GoTaq Green Master Mix, Promega. 
• Hướng dẫn sử dụng máy 3500Dx (ABI)

Từ viết tắt

• DNA: Deoxyribonucleic Acid  
• PCR: Polymerase Chain Reaction  
• HHPƯ: Hỗn hợp phản ứng  
• DTYH: Di truyền Y học 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0