Hướng dẫn thực hiện quy trình chuyên môn vi sinh vật nhiễm khuẩn sinh dục Real-time PCR đa tác nhân – Panel 3

Người thẩm định: Đoàn Mai Phương
Người phê duyệt: Phùng Nam Lâm
Ngày phát hành: 16/05/2022

1. Mục đích

Chuẩn hóa quy trình phát hiện đa tác nhân (Megasphaera Type 1 (Mega1), Lactobacillus spp. (Lacto), Bacteroides fragilis (BF), Gardnerella vaginalis (GV), Bacterial vaginosis–associated bacteria 2 (BVAB2), Atopobium vaginae (AV), và Mobiluncus spp. (Mob)) gây bệnh đường sinh dục qua phương pháp Realtime – PCR đa mồi.

2. Phạm vi

Quy trình này áp dụng cho mọi nhân viên phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện đa khoa Quốc tế Vinmec Times City.

3. Trách nhiệm

• Nhân viên được giao nhiệm vụ thực hiện xét nghiệm này tuân thủ đúng quy trình.
• Trưởng đơn nguyên, kỹ thuật viên trưởng đơn nguyên Vi sinh, trưởng tua trực chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ đúng quy trình.

4. Định nghĩa và từ viết tắt

• Realtime PCR (Realtime Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực.
• DPO (Dual Priming Oligonucleotide): Phân tử mồi kép.
• TOCE (Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension): Oligo đánh dấu phân tách và kéo dài.
• MuDT (Multiple Detection Temperatures): Phát hiện đa đích thông qua nhiệt độ.
• IC (Internal control): Nội chuẩn .
• XN: xét nghiệm.

5. Nguyên lý

• Realtime – PCR đa mồi là một phương pháp sinh học phân tử nhằm khuếch đại nhiều trình tự DNA chỉ trong một phản ứng PCR. Trong quá trình phân tích Realtime -PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng. Như một phương pháp cải tiến của phản ứng Realtime – PCR thông thường, phương pháp này giúp giảm số lượng phản ứng, giảm thao tác tiến hành, giảm thiểu lượng mẫu đầu vào mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.
• Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi có thể dẫn đến việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này và khuôn kia. Để khắc phục nhược điểm này, các kit xét nghiệm sử dụng phân tử mồi kép (Dual Priming Oligonucleotide – DPO) với cấu tạo đặc biệt gồm 3 thành phần: đầu dài 5’ và đầu ngắn 3’ được phân cách bởi liên kết polydeoxyinosine.

• Với đoạn mồi thông thường, việc sai lệch một vài nu thì vẫn có thể xảy ra hiện tượng gắn mồi không đặc hiệu, tạo thành các sản phẩm không đặc hiệu. Với DPO, nếu đầu 5 phút gắn không đặc hiệu vào khuôn thì đoạn linker sẽ cản trở đầu 3’ gắn vào khuôn, làm cho phản ứng tổng hợp không diễn ra. Nhờ đó, phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn không tạo ra các sản phẩm phụ.
• Bên cạnh đó, việc tối ưu hóa việc phát hiện cùng lúc nhiều đích khác nhau trong một phản ứng mà vẫn đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao thông qua công nghệ phát hiện tín hiệu huỳnh quang đa đích thông qua TOCE (Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension).

• Cốt lõi của công nghệ TOCE là hai phân tử Pitcher và Catcher. Phân tử Pitcher có hai phần: phần đích sẽ liên kết đặc hiệu với trình tự đích và phần đánh dấu thì không. Phân tử Catcher có hai phần: phần bắt giữ có trình từ bổ sung với phần đánh dấu của Pitcher và phần tạo khuôn chứa Reporter và Quechers có khả năng phát tín hiệu khi có hoạt tính của Exonuclease trượt qua. Trong khi DPO kéo dài, phân tử Pitcher sẽ bị phân cắt và giải phóng phần đánh dấu, phần đánh dấu này sẽ liên kết bổ sung với phần bắt giữ trên Catcher. Sau đó, kéo dài mạch và kết quả là tín hiệu được hình thành. Đầu tiên, các Pitcher khác nhau nhận biết các đích khác nhau sẽ gắn vào các Catcher có Tm khác nhau. Sử dụng phân tích đường cong nóng chảy cho phép phát hiện lên tới 3 phân tử đích trong cùng 1 kênh màu. Vậy với 5 kênh màu có thể phát hiện lên đến 15 loại phân tử đích khác nhau trong cùng 1 phản ứng.
• Với công nghệ TOCE, việc phát hiện đa đích cần thêm bước phân tích đường cong nóng chảy làm tăng đáng kể thời gian chạy máy gây kéo dài thời gian trả kết quả bệnh nhân. Khắc phục được vấn đề này, công nghệ định lượng đa đích MuDT (Multiple Detection Temperatures) cho phép phát hiện hai đích trong cùng một kênh màu giúp đưa ra các kết quả định lượng chính xác mà không cần bước phân tích đường cong nóng chảy. Khác với Realtime PCR thông thường chỉ đọc tín hiệu tại bước nhiệt độ gắn mồi, công nghệ MuDT cần đọc tín hiệu tại cả hai nhiệt độ gắn mồi và kéo dài. Ví dụ việc phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh là cúm A và cúm B với trị Tm lần lượt là 65 độ C và 75 độ C. Do đó, ở nhiệt độ 72 độ C chỉ có cúm B được tổng hợp còn ở nhiệt độ 60 độ C sẽ có sự tổng hợp của cả hai loại cúm. Kết thúc quá trình khuếch đại, đường cong khuếch đại ở 72 độ C biểu hiện quá trình tổng hợp của cúm B và ở 60 độ C là quá trình tổng hợp của của hai sản phẩm này. Kết hợp với phần mềm phân tích Seegene Laucher giúp loại bỏ tín hiệu cúm B ở 60 độ C thu được đường cong khuếch đại của cúm A.

• Qua đó, xác định được giá trị Ct của cả hai đích trong cùng một kênh màu mà không cần thêm bước phân tích đường cong nóng chảy giúp rút ngắn thời gian tiến hành tương tự như một phản ứng Realtime PCR thông thường. Khi sử dụng 4 kênh màu, công nghệ định lượng đa đích của Seegene có thể phát hiện lên đến 8 gen đích trong 1 ống phản ứng.

6. Loại mẫu sử dụng

Dịch phết sinh dục, dịch tế bào sinh dục (dịch âm đạo, dịch phết cổ tử cung, dịch niệu đạo) và nước tiểu.

7. Trang thiết bị và vật tư

7.1. Thiết bị

• Máy tách chiết DNA tự động.
• Máy Real – time PCR CFX96.
• Máy tính điều khiển.
• Máy vortex.
• Máy spindown.

7.2. Hóa chất

• Hóa chất chính:
  • Bộ kit xét nghiệm các tác nhân gây bệnh qua đường sinh dục AllplexTM Bacterial Vaginosis Assay của Hãng Seegene.
• Các phụ kiện:
  • Cồn tuyệt đối.

7.3. Dụng cụ

• Bộ pipet 20 μl, 100 μl và 1000 μl.
• Đầu côn 20 μl, 100 μl và 1000 μl.
• Ống Eppendorf 1.5 ml.
• Strip 8 giếng đục của Bio-Rad.
• Nắp strip 8 giếng của Bio-Rad.
• Cốc xả.

8. Chuẩn bị bệnh nhân

Không áp dụng

9. Quy trình chuyên môn vi sinh vật nhiễm khuẩn sinh dục Real-time PCR đa tác nhân – Panel 3

9.1. Chuẩn bị

9.1.1. Chuẩn bị dụng cụ

• Kiểm tra hoạt động của pipet và điều chỉnh pipet về thể tích cần lấy.
• Kiểm tra số lượng đầu côn đủ.
• Kiểm tra số lượng ống Eppendorf 1.5 ml.
• Kiểm tra số lượng strip và nắp tương ứng.
• Đổ cốc xả trước khi làm xét nghiệm.

9.1.2. Chuẩn hóa chất

Bộ kit Multiplex Realtime – PCR AllplexTM Bacterial Vaginosis Assay.

• Với lần đầu sử dụng:
  • Ghi lại ngày mở hộp.
  • Để ở nhiệt độ phòng 30 phút để các hóa chất rã đông hoàn toàn.
  • Do số lần rã đông của kit ≤ 5 lần, nên trong trường hợp mix phản ứng thủ công và số lượng mẫu xét nghiệm nhỏ, cần chia nhỏ thể tích hóa chất để tránh rã đông nhiều lần.
• Với các lần sử dụng tiếp theo:
  • Để ở nhiệt độ phòng 30 phút để các hóa chất rã đông hoàn toàn.
  • Đánh dấu lại số lần rã đông.

9.2. Xử lý bệnh phẩm

• Dịch phết cổ tử cung:
  • Vortex đều và lấy 300 μl chuyển vào ống Eppendorf 1.5 ml.
• Dịch tế bào:
  • Dịch tế bào nên được lấy vào ống Thin Prep và sử dụng 300 μl chuyển vào ống Eppendorf 1.5 ml.
• Nước tiểu:
  • Lắc đều và lấy 300 μl chuyển vào ống Eppendorf 1.5 ml.

9.3. Thực hiện xét nghiệm

• Thao tác trên máy tính điều khiển máy CFX96
  • Mở phần mềm “Bio-Rad CFX Manager IVD” chọn “File”  “New”  “Protocol” để vào giao diện “Protocol Editor”

• • Trong giao diện “Protocol Editor” cài đặt chu trình nhiệt theo bảng sau

• • Đọc tín hiệu ở 60 độ C và 72 độ C
  • Nhập vào ô “Sample Volume” là 20 μl  Chọn “OK”

• • Trong giao diện “Experiment Setup” chọn “Plant” tab, chọn “Creat New” để mở cửa sổ “Plate Editor”
  • Chọn “Select Fluorophores” để lựa chọn các kênh màu (FAM, HEX, Cal Red 610 và Quasar 670) sau đó chọn OK

• • Chọn các giếng và loại mẫu ở từng giếng trong menu “Sample Type”
    • Unknown: Mẫu bệnh nhân
    • Negative Control: Chứng âm
    • Positive Control: Chứng dương
  • Chọn các kênh màu (FAM, HEX, Cal Red 610 và Quasar 670) với các giếng được chọn.
  • Nhập tên mẫu trong ô “Sample Name”, kết thúc bằng phím Enter

• • Trong phần “Settings” của giao diện “Plate Editor” chọn “Plate Size (96 wells)” và “Plate Type (BR White)

• • Chọn “OK” để chuyển về giao diện “Experiment Setup”
  • Trong “Start Run” tab trong giao diện “Experiment Setup”, chọn “Close Lid” để đóng nắp thiết bị
  • Chọn “Start Run” sẽ xuất hiện màn hình lưu file chạy. Chọn nơi lưu trữ và nhập tên file, chọn “Save” và chương trình sẽ bắt đầu chạy

• Phân tích dữ liệu
  • Sau khi chạy máy chạy xong, chọn “Quantitaion” tab để chắc chắn rằng có đường khuếch đại

• • Chọn “Setting” => “Analysis Mode” => “No Baseline Subtraction”
  • Chọn “Tools” => “Seegene Export” chọn nơi để lưu trữ file dữ liệu xuất ra và chọn “OK”

• • Mở phần mềm “Seegene Viewer” và chọn “Open” để tìm đến folder “QuantStep4” trong file đã lưu trữ.

• • Sau khi mở được file kết quả, chọn loại kit sử dụng trong “Product” menu. Và kết quả của mỗi giếng sẽ xuất hiện trên màn hình.

9.3. Lưu hủy mẫu bệnh phẩm

Theo Quy trình lưu và hủy mẫu bệnh phẩm sau xét nghiệm.

10. Kiểm tra chất lượng

10.1. Các việc cần kiểm tra trước và sau khi thực hiện quy trình

• Trước khi thực hiện:
  • Kiểm tra hạn sử dụng và tình trạng của hóa chất trước khi sử dụng.
  • Hóa chất PCR cần phải rã đông hoàn toàn, vortex và spindown trước khi sử dụng.
• Sau khi thực hiện:
  • Đổ rác và thay túi thải mới.

10.2. Các yêu cầu hiệu chuẩn

Các máy móc và trang thiết bị liên quan cần được hiểu chuẩn định kỳ 6 tháng 1 lần

10.3. Các quy trình kiểm tra chất lượng IQC & EQA

• Nội kiểm:
  • Đánh giá kết quả IQC: IQC được đánh giá thường xuyên thông qua mỗi lần chạy mẫu. Kết quả QC được chấp nhận khi đồng thời thỏa mãn các thông số sau:
    • Âm tính ở chứng âm.
    • Với IC, giá trị Ct ≤ 40.
    • Với chứng dương, giá trị Ct ≤ 40 xuất hiện ở tất cả các gen đích.
  • Khi QC ngoài phạm vi kiểm tra

• • Tần suất xem xét kết quả QC: IQC phải được thực hiện thường xuyên trong mỗi mẻ chạy.

• Ngoại kiểm (EQA): Tham gia ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn/ phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn.

11. An toàn

• Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo Chương trình an toàn phòng xét nghiệm.
• Thực hiện bảo hộ cá nhân đầy đủ khi tiếp xúc với các bệnh phẩm và tránh nhiễm chéo và không lây nhiễm cho nhân viên y tế.
• Trong trường hợp đánh đổ bệnh phẩm, phải cẩn thận làm sạch nơi bị đổ cùng với chất sát khuẩn để đảm bảo an toàn sinh học.

12. Dải tuyến tính

Không áp dụng.

13. Diễn giải và báo cáo kết quả

• Kết quả được phân tích và diễn giải tự động thông qua phần mềm “Seegene Viewer for Real- time Instruments V3” cho ra kết quả như dưới hình.

• Kí hiệu: Megasphaera Type 1 (Mega1), Lactobacillus spp. (Lacto), Bacteroides fragilis (BF), Gardnerella vaginalis (GV), Bacterial vaginosis–associated bacteria 2 (BVAB2), Atopobium vaginae (AV), và Mobiluncus spp. (Mob) và Internal Control (IC).

14. Các yếu tố ảnh hưởng

14.1. Các yếu tố nguy cơ tiềm tàng

• Cơ sở vật chất:
  • Phòng thí nghiệm không đáp ứng các tiêu chuẩn của phòng sạch.
  • Máy lỗi đột xuất.
• Con người:
  • Sai sót trong các khâu: lấy mẫu, bảo quản mẫu, bảo quản hóa chất, lấy nhầm mẫu, lấy nhầm hóa chất, cài đặt sai chương trình chạy máy.

14.2. Các chú ý để đảm bảo tốt kết quả của quy trình

• Trước khi tiến hành xét nghiệm:
  • Dán tên và mã số bệnh nhân lên ống trước khi lấy mẫu bệnh phẩm
  • Lấy mẫu và bảo quản mẫu đúng quy định
  • Hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện
• Trong khi tiến hành xét nghiệm:
  • Các hóa chất cần được rã đông hoàn toàn và vortex
  • Mẫu đưa vào máy tách chiết tự động không nên có cặn do có thể làm tắc đầu côn trong quá trình hút mẫu của máy, gây lỗi máy trong quá trình tách chiết
  • Lựa chọn đúng chương trình chạy máy
  • Mẫu đặt vào máy tách chiết theo hình rích rắc do đó cần chú ý vị trí đặt mẫu vào máy cần chính xác để tránh gây nhầm mẫu
  • Sử dụng đầu côn có lọc trong toàn bộ quá trình tháo, đổi đầu côn khi thao tác với các mẫu cũng như các ống hóa chất khác nhau tránh gây nhiễm chéo giữa các mẫu
  • Khi có hiện tượng rơi rớt mẫu trong quá trình thao tác, cần xử lý theo đúng quy trình
  • Kiểm tra lại thứ tự mẫu trước khi lấy ra khỏi máy tách chiết để tránh nhầm mẫu
  • Cẩn trọng trong quá trình bổ sung mẫu vào strip PCR, phải chắc chắn rằng bổ sung đúng mẫu và đúng thể tích vào đúng ống PCR trên strip. Nếu kỹ thuật viên tiến hành cảm thấy không chắc chắn nên tiến hành lại. Trong quá trình này cũng cần thao tác chính xác và dứt khoát tránh hiện tượng rơi rớt mẫu vào các ống PCR khác gây nhiễm.
  • Chu trình nhiệt độ phải đảm bảo chính xác để không ảnh hưởng đến khả năng khuếch đại mẫu trong phản ứng PCR
• Sau khi tiến hành xét nghiệm:
  • Tại phần mềm phân tích Seegene Viewer, vị trí mẫu trong máy PCR và phần mềm cần phải trùng khớp nhau và chọn chính xác loại kit sử dụng “PRODUCT” để kết quả được đọc chính xác nhất.
  • Cần dọn dẹp và khử trùng UV sau khi tiến hành các xét nghiệm.

15. Lưu hồ sơ

Ghi chép rõ ràng kết quả vào hệ thống mạng Labconn.

16. Tài liệu liên quan

• Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm
• Quy trình lưu và hủy bệnh phẩm sau xét nghiệm

17. Tài liệu tham khảo

• AllplexTM Bacterial Vaginosis Assay – User’s Guide
• Seegene Viewer (V3) for Real-time Instruments – Setup and User’s Guide
• Seegene Launcher IVD V6 – User Guide

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết
VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.  

0