Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 22/11/2019
Ngày hiệu chỉnh: 18/03/2021

1. Mục đích

Hướng dẫn dẫn các chuyên viên và kỹ thuật viên làm việc tại Trung tâm Công nghệ cao Vinmec thực hiện đúng kỹ thuật thu hoạch tế bào gốc trung mô.

2. Định nghĩa và các khái niệm liên quan thu hoạch tế bào gốc trung mô

• Tế bào gốc trung mô (hay còn gọi là Mesenchymal Stem Cells, MSCs) là tế bào gốc đa năng có khả năng biệt hoá thành các tế bào khác như tế bào mỡ, sụn, xương, tế bào thần kinh… và có nhiều ứng dụng trong y học hiện đại và y học tái tạo. Các dòng tế bào gốc trung mô có thể được phân lập từ nhiều mô khác nhau, như tủy xương, mô mỡ, dây rốn…
• Thu hoạch tế bào gốc trung mô là một quy trình được sử dụng để thu tế bào gốc trung mô sau quá trình nuôi cấy tăng sinh để đưa vào ứng dụng lâm sàng.

3. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất

3.1. Thiết bị

Ghi chú: Trong trường hợp cần thiết, các sản phẩm trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm khác có tính chất và độ an toàn tương tự.

3.2. Vật tư tiêu hao

Ghi chú: Trong trường hợp cần thiết, các sản phẩm trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm khác có tính chất và độ an toàn tương tự.

3.3. Hóa chất

Ghi chú: Trong trường hợp cần thiết, các sản phẩm trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm khác có tính chất và độ an toàn tương tự.

4. An toàn

• Đọc, hiểu quy trình và được đào tạo trước khi thực hiện quy trình.
• Tuân thủ các quy định về kiểm soát nhiễm khuẩn và chất thải độc hại được quy định trong thông tư liên tịch số 58/2015/TT-BYT-BTNMT.
• Tuân thủ các hướng dẫn an toàn trong phòng thí nghiệm theo quy định an toàn sinh học trong Nghị định 103/2016/NĐ-CP.
• Tuân thủ đúng và chính xác các bước thực hiện được nêu trong quy trình này.

5. Quy trình thu hoạch tế bào gốc trung mô với mục đích truyền cho người bệnh

• Lưu ý chung: Các hóa chất và vật tư phải được kiểm tra bao bì, tính vô trùng, khử trùng, khử khuẩn (xịt cồn 70%) trước khi sử dụng và trước khi đưa vào tủ an toàn sinh học.
• Quan sát tế bào dưới kính hiển vi (thực hiện thu hoạch khi tế bào đạt độ phủ bề mặt ≥70%), kiểm tra kỹ môi trường các dấu hiệu của nhiễm khuẩn (môi trường vẩn đục, có mùi khi mở nắp chai nuôi cấy) và lưu trữ hình ảnh của tế bào trước khi thu hoạch.
• Hút bỏ dung dịch nuôi cấy trong chai nuôi cấy sau đó rửa lại bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch PBS theo bảng hướng dẫn dưới đây:

Ghi chú: Bổ sung dung dịch PBS bằng cách sử dụng serological pipette và hướng dung dịch vào cạnh bên của chai nuôi cấy. 

• Hút bỏ hoàn toàn dung dịch PBS và thêm vào chai nuôi cấy dung dịch enzyme TryPLE select theo hướng dẫn dưới đây, ủ trong tủ nuôi cấy ở 37ºC trong tối thiểu 3 phút và tối đa 10 phút.

• Vỗ nhẹ cạnh bên của chai nuôi cấy để tế bào rời khỏi bề mặt chai nuôi cấy, quan sát nhanh dưới kính hiển vi nếu cần thiết.
• Trung hoà hoạt tính của enzyme bằng cách thêm môi trường nuôi cấy với thể tích ít nhất bằng 1/2 thể tích TrypLE đã cho trước đó.
• Hút nhả bằng serological pipette (từ 3-5 lần) để thu toàn bộ tế bào sau khi xử lý bằng enzyme và chuyển vào ống ly tâm thích hợp.
• Tráng chai nuôi cấy bằng PBS (nếu cần), chuyển vào ống ly tâm.
• Ly tâm với tốc độ 400g trong vòng 4 phút, 20ºC.
• Sau khi ly tâm, hút bỏ toàn bộ dung dịch và hoà tế bào nhẹ nhàng với 45 ml dung dịch truyền (natri clorid 0,9% hoặc Ringer lactate) để rửa tế bào (có thể dùng bơm tiêm 50ml hút dung dịch trong chai dung dịch truyền và nhả thẳng vào thành ống đựng tế bào hoặc chuyển vào ống ly tâm 50ml vô khuẩn).
• Đếm tế bào thu được và xác định tỷ lệ sống bằng phương pháp nhuộm với Trypan Blue.
• Trộn 10 µl dung dịch tế bào với 10 µl thuốc nhuộm Trypan Blue. Nhỏ 10 µl dung dịch thu được bào buồng đếm tế bào. Xác định tổng số tế bào sống thu được và tỷ lệ sống bằng các công thức sau đây:

Tổng số tế bào thu được = Số tế bào sống trung bình trong 1 ô × Hệ số pha loãng × 104 × Thể tích dung dịch tế bào Tỷ lệ tế bào sống = Số tế bào sốngTổng số tế bào sống và chếtx100%

• Ly tâm với tốc độ 400g trong vòng 4 phút, tại 20ºC.

• Sau khi ly tâm, thực hiện xét nghiệm cấy khuẩn, nấm, Endotoxin, Mycoplasma trên dịch rửa tế bào. Sau đó chuyển dịch rửa tế bào vào ống ly tâm 50ml mới, dán PID và lưu tại 4ºC ít nhất 1 tuần sau khi truyền.
• Hoà tế bào nhẹ nhàng trong dung dịch truyền (natri clorid 0,9% hoặc ringer lactate). Thể tích dung dịch truyền tùy thuộc vào chỉ định của bác sĩ. Liều tế bào truyền là 1×106 tế bào/kg cân nặng. Với các bệnh nhân truyền khớp gối, liều truyền là 10×106 tế bào/khớp. Thể tích cần để hòa tế bào được tính theo tính theo công thức sau:

Thể tích dung dịch cần để hoà tế bào = Thể tích dung dịch truyền x Tổng số tế bàoTổng số tế bào cần truyền Ghi chú: Trong trường hợp số lượng tế bào còn dư sau khi chuẩn bị mẫu truyền, lưu các tế bào còn dư này trong 01 ống ly tâm 50ml vô khuẩn, dán PID và lưu tại 4ºC cùng với dịch rửa trong thời gian 7 ngày để hậu kiểm.

• Thể tích truyền và số tế bào cần truyền tùy thuộc từng chỉ định (tham khảo theo bảng sau đây) hoặc theo yêu cầu của bác sĩ điều trị.

• Dùng bơm tiêm 20ml hút đủ lượng dung dịch chứa số lượng tế bào cần truyền, dán PID lên bơm tiêm và đặt vào trong hộp inox vô trùng, bọc với xăng và dán PID bên ngoài xăng.
• Khi khối tế bào đủ tiêu chuẩn truyền theo hướng dẫn trong “Quy trình kiểm tra chất lượng sản phẩm tế bào gốc với mục đích truyền cho bệnh nhân”, chuyển sản phẩm đến phòng truyền trong thời gian sớm nhất có thể. Trong trường hợp phải chờ phía lâm sàng, sản phẩm tế bào phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 4ºC – 8ºC với thời gian tối đa là 24h.
• Hoàn thiện các thông tin trong Phiếu thu hoạch tế bào gốc trung mô.

5. Kiểm soát chất lượng

• Thực hiện xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn và vi nấm dịch rửa tế bào của mẫu truyền tại thời điểm thu hoạch theo “Cẩm nang hướng dẫn sử dụng dịch vụ xét nghiệm STLM.TC.001.V2.1.
• Thực hiện xét nghiệm Mycoplasma, Endotoxin dịch rửa tế bào của mẫu truyền truyền tại thời điểm thu hoạch theo SOP “Phát hiện Mycoplasma bằng kit MycoAlert” và “Xét nghiệm xác định nồng độ nội độc tố vi khuẩn bằng máy ENDOSAFE – PTS”.

6. Xử lý mẫu, dụng cụ và chất thải

• Phân loại, xử lý rác thải đúng nơi quy định
• Vệ sinh toàn bộ bề mặt tủ an toàn sinh học bằng dung dịch khử khuẩn và cồn 70 độ
• Vệ sinh tất cả các thiết bị và bề mặt đã tiếp xúc như máy ly tâm đã sử dụng, máy tính, mặt bàn, mặt tủ.

7. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

• Phiếu thu hoạch tế bào gốc trung mô
• Phiếu kết quả sản phẩm tế bào gốc trung mô

Tài liệu tham khảo

1. Bieback K, Kinzebach S, Karagianni M (2011), Translating research into clinical scale manufacturing of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Int 2010:193519.
2. Sensebe L, Bourin P, Tarte K (2011) Good manufacturing practices production of mesenchymal stem/stromal cells. Hum Gene Ther22:19–26.
3. Thirumala S, Goebel WS, Woods EJ (2013), Manufacturing and banking of mesenchymal stem cells. Expert Opin Biol Ther 13:673–691.
4. Perez-Ilzarbe M, Diez-Campelo M, Aranda P, et al (2009) Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion 49:1901–1910.
5. Furue M K, Ozawa M, Ozawa Y, Iemura M, Kohara A, Yanagihara K (2014) A simple improvement of the conventional cryopreservation for human ES and iPS cells. Protocol Exchange.

Từ viết tắt

• MSC: Mesenchymal Stem Cells
• PBS: Phosphate Buffer Saline
• PID: Patient Identification.

Ghi chú: Văn bản được phát hành lần thứ hai thay thế văn bản “Quy trình thu hoạch tế bào gốc trung mô” (mã số VMEC_CN18) phát hành ngày 22/11/2019.
Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản.
Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có.
Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0