Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo 
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích  

•  Hướng dẫn cho nhân viên phòng thí nghiệm thực hiện quy trình tách chiết và lưu trữ DNA tử máu ngoại vi, mẫu dịch ối hay mẫu gai nhau sinh thiết.  
• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện

2. Nguyên lý  

• DNA từ mẫu máu ngoại vi, tế bào ối và gai nhau được tách chiết dựa vào khả năng bám của axit nucleic lên màng silica QIAamp dưới tác dụng lực ly tâm. Mẫu được ly giải bằng proteinase K và dung dịch đệm (AL) chứa guanidine hydrochloride, có khả năng biến tính cao, bất hoạt enzyme nuclease để đảm bảo phân tử DNA được giữ nguyên vẹn trong quá trình tách chiết. Điều kiện môi trường đệm được điều chỉnh pH, nồng độ muối, bổ sung ethanol để tối ưu khả năng bám của DNA vào màng QIAamp silica. Protein và các tạp chất không bám được vào màng QIAamp sẽ được loại bỏ bằng dung dịch rửa AW1 và AW2. DNA sẽ được rửa giải và thu hồi bằng dung dịch đệm AE.

3. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

•  Proteinase K là một enzyme phân hủy màng tế bào và màng nhân để giải phóng DNA.  
• Màng silica là một loại màng đặc biệt dùng để giữ axit nuleotid.

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất thực hiện tách chiết và lưu trữ DNA từ máu ngoại vi

4.1. Hóa chất

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3.  Thiết bị 

5. An toàn

• Không được ăn uống, hút thuốc hoặc trang điển ở khu vực làm xét nghiệm.  
• Mặc áo bảo hộ và đeo găng tay y tế khi tiếp xúc với mẫu bệnh phẩm và hóa chất của bộ kít.  
• Rửa kỹ tay sau khi làm.  
• Loại bỏ tất cả chất thải tiếp xúc với bệnh phẩm vào thùng chất thải sinh học nguy hại.  
• Đệm AL và AW1 có chứa guanidine hydrochloride, một chất hóa học có hoạt tính mạnh khi kết hợp với bleach. Nếu dung dịch bị tràn đổ thì làm sạch với nước và hóa chất phù hợp.  
• Tuân thủ mọi quy định về an toàn lao động và vệ sinh môi trường của phòng xét nghiệm.

6. Quy trình kỹ thuật thực hiện 

6.1. Loại mẫu  

• 2ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA  
• 10 – 15ml mẫu dịch ối  
• 10-20mg mẫu gai nhau sinh thiết đựng trong ống ly tâm 15ml vô khuẩn. 

6.2. Tiếp nhận mẫu 

• Khách hàng được chỉ định thực hiện từ bác sĩ lâm sàng ở các khoa khám bệnh, lấy mẫu tại phòng lấy mẫu, sau đó mẫu được chuyển ngay sang bên bộ phận tiếp nhận của khối Di truyền Y học (DTYH).  
• Nhân viên thực hiện xét nghiệm nhận mẫu, Ghi nhãn LID, ghi thông tin trong sổ quản lý mẫu theo hướng dẫn trong quy trình “Tiếp nhận yêu cầu xét nghiệm” (QTKT01). 

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình  

• Trước khi thực hiện 
  • Để mẫu ở nhiệt độ phòng trước (15–25°C) 
  • Cài đặt nhiệt độ của bể ổn nhiệt ở 56°C. 
  • Nếu đệm AL hoặc ATL lắng cặn, thì làm tan bằng cách làm nóng đến 56𝇈C. 
  • Đảm bảo rằng Buffer AW1, Buffer AW2, and QIAGEN Protease được được chuẩn bị theo hướng dẫn trên vỏ lọ.  

• Quy trình thực hiện: 
  • DNAGhi biểu mẫu “Phiếu theo dõi thực hiện tách DNA”, ghi thông tin các mẫu sẽ được tách theo yêu cầu. Biểu mẫu này được đặt tại phòng Tách chiết DNA 
  • Với mẫu gai nhau, cần tách và rửa tua gai nhau theo các bước  
    • Rửa tua gai nhau bằng RPMI/PBS để loại bỏ máu bám trên sợi tua.  
    • Soi dưới kính hiển vi, sử dụng kim để bóc tách lõi tua nhau ra khỏi lớp tế bào màng rụng mẹ.  
    • Rửa lại sợi tua nhau bằng RPMI/PBS để loại tế bào rụng. 

• Ly tâm thu sinh khối tế bào ối và gai nhau với tốc độ 1800 rpm trong 5 phút. 
• Từ bước này, các bước thực hiện kỹ thuật sẽ hoàn toàn giống nhau đối với 3 loại mẫu bệnh phẩm: máu ngoại vi, tế bào ối hoặc gai nhau sau ly tâmCho 20 µl QIAGEN Protease vào đáy ống nghiệm chứa khoảng 200 µl dịch tế bào ối (hoặc gai nhau) sau ly tâm 
• Nếu lượng mẫu không đủ 200µl có thể bổ sung lượng PBS 1X vừa đủ. 
• Thêm 200µl Buffer AL vào ống đựng mẫu, lắc đều khoảng 15 giây 
• Để đảm bảo quá trình ly giải tế bào hiệu quả, điều cần thiết là mẫu và dịch AL phải được trộn đều đồng nhất. Nếu lượng mẫu lớn hơn 200µl, cần tăng lượng QIAGEN Protease và Buffer AL cho phù hợp. 

Chú ý: Không bổ sung trực tiếp QIAGEN Protease vào dung dịch Buffer AL. 

• Ủ các ống tại 56ºC trong 10 phút 
• Sau khi ủ, thấm khô ống chứa mẫu và ly tâm nhanh (3000 vòng/phút trong 15 giây). 
• Tra 200 µl ethanol (96-100%) vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trong 15 giây. Sau đó, ly tâm nhanh (3000 vòng/phút trong vòng 15 giây). 
• Chuyển toàn bộ hỗn hợp trong ống vào cột ly tâm có màng lọc. Đây là bước dễ nhầm lẫn giữa các mẫu, bắt buộc có người kiểm tra chéo thông tin mẫu và ký tên vào biểu mẫu. 

Lưu ý:  

• Khi tra mẫu vào cột, tránh làm ướt vành trên của cột.  
• Khi mở nắp cột, thao tác cẩn thận để tránh tạo các hạt dung khí.  
•  Tránh chạm đầu côn vào lớp màng lọc của cột.  
• Mỗi lần chuyển không quá 700 µl hỗn hợp ly giải mẫu. 
• Đậy nắp cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. 
  • Chuyển cột sang ống thu 2 ml mới, thải bỏ ống 2ml cũ chứa dung dịch sau ly tâm. Lặp lại bước 1.9 nếu thể tích hỗn hợp ly giải mẫu lớn hơn 700 µl. 
  • Tra 500 µl dung dịch AW1 vào cột. 
  • Ly tâm cột tại 8000 vòng/phút trong 1 phút. 
  • Chuyển cột sang ống 2 ml mới, thải bỏ ống 2ml cũ chứa dung dịch sau ly tâm. 
  • Tra 500 µl dung dịch AW2 vào cột. 
  • Ly tâm cột tại 14000 vòng/phút trong 3 phút. 
  • Chuyển cột sang ống 2 ml mới, thải bỏ ống 2ml cũ chứa dung dịch sau ly tâm. 
  • Ly tâm cột tại 14000 vòng/phút trong 1 phút. 
  • Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới đã được ghi tên mẫu tương ứng. Đây là bước dễ nhầm lẫn giữa các mẫu, bắt buộc cần người kiểm tra chéo thông tin trước khi chuyển cột và ký tên vào biểu mẫu. 
  • Tra 50 → 200 µl (tuỳ theo yêu cầu của quy trình xét nghiệm) đệm AE hoặc nước sạch miliQ vào giữa lớp màng của cột để thu hồi DNA. 
  • Đóng nắp và ủ cột tại nhiệt độ phòng trong vòng 2 phút. 
  • Ly tâm cột tại 8000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi DNA tinh sạch. 

7. Kiểm soát chất lượng  

• Mẫu phải được ly giải hoàn hoàn toàn sau bước ủ với proteinase K.  
• Chỉ số 280/260 = 1.8 -2.0. 

8. Xử lý mẫu và chất thải  

• Mẫu sau khi thực hiện xét nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ -80°C trong 3 năm.  
• Tuân thủ quy trình xử lý chất thải y tế  
• Tiến hành vệ sinh các thiết bị và bề mặt xét nghiệm bằng cồn 70°. 

9. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục   

Phụ lục 1: Biểu mẫu theo dõi tách chiết và lưu trữ DNA: BM01: XNG-65  Phụ lục 2. Lưu đồ thực hiện quy trình tách chiết và lưu trữ DNA Phụ lục 3: Bảng kiểm thực hiện quy trình tách chiết và lưu trữ DNA từ tế bào ối và gai nhau

Tài liệu liên quan  

• Quy trình tiếp nhận yêu cầu xét nghiệm  
• Quy trình kỹ thuật “Tách chiết DNA tổng số”  
• Quy trình kỹ thuật “Duy trì cơ sở vật chất và điều kiện môi trường” 

Tài liệu tham khảo  

• QIAamp DNA blood mini kit protocol, QIAGEN. 

Từ viết tắt:  

• DNA: Deoxyribonucleic Acid  

• DTYH: Di truyền Y học 

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0