Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 09/03/2021 Ngày hiệu chỉnh: 08/10/2021

1. Mục đích 

Hướng dẫn các chuyên viên và kỹ thuật viên làm việc tại Trung tâm Công nghệ cao thực hiện đúng kỹ thuật phân lập thể tiết ngoại bào (Exosomes) từ môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô dây rốn cho trẻ hóa da.

2. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

Thể tiết ngoại bào (extracellular vesicles, EVs) là các túi nhỏ được đóng gói bởi lớp màng lipid kép giống như màng tế bào và được tiết ra từ nhiều loại tế bào khác nhau. Thể tiết ngoại bào được phân làm ba loại: (1) thể tế bào chết theo chương trình (apoptotic body – AB, 1000 – 5000 nm) là sản phẩm của quá trình tế bào đi vào chết theo chương trình, vi thể (microvesicles – MVs, 100 – 1000 nm) được hình thành bằng cách mọc chồi trực tiếp từ màng tế bào và thể exosomes (EXs, 30 – 150 nm) được hình thành do sự nhập nội bào và giải phóng ra môi trường ngoại bào bằng cơ chế xuất bào. Thể tiết exosomes đã được chứng minh là có tham gia vào quá trình liền vết thương, điều hòa miễn dịch, điều trị các bệnh lý tim mạch, bệnh lý thần kinh, chống hình thành khối u và trong cả y học tái tạo. Phân lập thể tiết ngoại bào exosomes từ môi trường nuôi cấy có điều kiện của các loại tế bào gốc trung mô là quy trình kỹ thuật được sử dụng để thu được sản phẩm thể tiết exosomes tinh sạch không bị tạp nhiễm bởi các quần thể EV kích thước lớn và các phân tử protein kích thước lớn kết cụm lại bằng cách sử dụng phương pháp siêu ly tâm với các trường lực khác nhau.

3. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất phân lập thể tiết ngoại bào

3.1. Thiết bị

Ghi chú: Trong trường hợp cần thiết, các sản phẩm trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm khác có tính chất và độ an toàn tương tự

3.2. Vật tư tiêu hao

Ghi chú: Trong trường hợp cần thiết, các sản phẩm trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm khác có tính chất và độ an toàn tương tự

3.3. Hóa chất, sinh phẩm

Ghi chú: Trong trường hợp cần thiết, các sản phẩm trên có thể được thay thế bằng các sản phẩm khác có tính chất và độ an toàn tương tự

4. An toàn

• Người thực hiện quy trình này có nghĩa vụ phải đọc, hiểu quy trình trước khi tiến hành thực hiện.
• Thực hiện chính xác các quy định về đồ bảo hộ cá nhân và các biện pháp an toàn khi thực hiện quy trình theo quy định của TT CNC.
• Đảm bảo các quy trình phải được thực hiện đúng, chính xác, và đầy đủ.

5. Quy trình kỹ thuật thực hiện

5.1. Tóm tắt quy trình (Workflow)

Xem chi tiết

5.2. Chuẩn bị mẫu

• Loại mẫu:
  • Môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô theo mẻ hoặc tận dụng từ môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô dây rốn trong điều trị bệnh
  • Các dòng tế bào gốc trung mô được sử dụng để nuôi cấy cho mục đích thu hoạch môi trường để phân lập exosomes đều phải được kiểm tra chất lượng và hiện đang lưu trữ tại ngân hàng tế bào gốc
  • Môi trường nuôi cấy tế bào gốc trung mô cho mục đích thu thể tiết ngoại bào exosomes cho trẻ hóa da được bảo quản trong ống/ chai đóng kín, không có dấu hiệu rò rỉ hoặc tràn đổ.
  • Mẫu cần đầy đủ thông tin bệnh nhân (PID), loại môi trường sử dụng để nuôi cấy tế bào MSCs, số lần cấy chuyển, số ngày nuôi cấy, thể tích môi trường và số lượng tế bào thu được.

5.3. Chuẩn bị vật tư và các thiết bị sử dụng

• Mở nguồn điện máy siêu ly tâm, sau đó mở nắp và vệ sinh bên trong buồng máy siêu ly tâm bằng ethanol 70% trước khi sử dụng.
• Vệ sinh bộ rotor SW 32Ti bằng ethanol 70% và bảo quản ở 4ºC để làm lạnh từ trước (để qua đêm hoặc thời gian tối thiểu 4 giờ trước khi sử dụng).
• Vệ sinh adaptor bằng ethanol 70% và để ở 4ºC qua đêm (hoặc thời gian tối thiểu 4h) để làm lạnh trước khi sử dụng. Khi sử dụng, đưa adaptor vào trong tủ an toàn sinh học cấp II.
• Khử trùng các ống ly tâm (Thinwall Ultraclear 38,5mL) bằng ethanol 70% một lần trước, sau đó tráng lại bằng PBS 1X hai lần, để khô tự nhiên trong tủ ATSH trước khi tiến hành thực hiện 1 giờ. Đối với các ống ly tâm Thick Wall (polypropylene) thì hấp tiệt trùng trước khi sử dụng.

5.4. Ly tâm loại bỏ vi thể (microvesicles) và thể tế bào chết theo chương trình (apoptotic bodies)

• Dùng pipet để hút dịch nuôi tế bào vào ống ly tâm Thinwall Ultraclear 38,5mL đã khử trùng sao cho thể tích các ống bằng nhau và đạt tối thiểu 2/3 thể tích ống.
• Cân bằng các ống ly tâm có chứa dịch nuôi tế bào và ống đối trọng. Dịch trong ống đối trọng có thể là PBS 1X hoặc dịch nuôi cấy tế bào.
• Chuyển adaptor của rotor SW 32Ti đã để lạnh vào tủ ATSH.
• Đưa các ống ly tâm chứa dịch nổi và ống đối trọng đã cân bằng vào bộ adaptor của rotor SW 32Ti theo thứ tự.
• Sử dụng gạc sạch để vệ sinh một lần nữa rotor đã được bảo quản trong 4ºC trước đó. Lắp các adaptor chuẩn bị ở bước trên vào rotor.
• Đặt rotor vào trong máy siêu ly tâm và đóng chặt cửa máy. Sau đó thiết lập chương trình chạy: loại rotor SW 32Ti, loại ống Thinwall Ultra Clear 38,5mL, lực ly tâm: 16.500 x g, thời gian: 30 phút, nhiệt độ: 4ºC, gia tốc: maximum, giảm tốc: maximum.
• Tiến hành ly tâm: bật hút chân không (Open vent, Start vacuum), đợi cho đạt mức < 250 µL thì tiến hành chạy máy (Start).
• Khi kết thúc quá trình ly tâm, bơm chân không vào buồng máy ly tâm (Open vent), mở nắp máy và lấy rotor ra khỏi máy. Chuyển các adaptor vào tủ ATSH, sau đó dùng nhíp y tế gắp ống ly tâm ra khỏi adaptor và đặt ống ly tâm chứa dịch nổi vào giá đỡ.
• Thu dịch nổi chuyển sang các ống ly tâm đã khử trùng (Thinwall Ultraclear 38,5mL) sao cho thể tích các ống bằng nhau và đạt tối thiểu 2/3 thể tích ống để tiến hành thu exosomes vào bước tiếp theo.

Chú ý: Sử dụng pipet serological 25mL từ từ hút dịch nổi cho đến khi thể tích dịch nổi trong ống cách cặn dưới đáy ống còn 2 cm thì chuyển sang sử dụng pipet đơn kênh để thu toàn bộ dịch nổi. Các thao tác phải thực hiện nhẹ nhàng sao cho cặn vi thể không bị bong khỏi đáy ống và lẫn vào dịch nổi (quan sát bằng mắt thường).

• Loại bỏ cặn vi thể và tế bào chết theo chương trình còn lại trong ống sau khi thu dịch nổi.

5.5. Ly tâm thu Exosomes

• Chuyển các ống ly tâm chứa dịch nổi từ bước 3 và ống đối trọng đã cân bằng vào bộ adaptor của rotor SW 32Ti theo thứ tự.
• Rotor được bảo quản trong 4ºC sẽ được lấy ra, lắp các adaptor chuẩn bị ở bước trên vào rotor. Sử dụng gạc để vệ sinh lại rotor một lần nữa.
• Đặt rotor vào trong máy siêu ly tâm và đóng chặt cửa máy. Sau đó thiết lập chương trình chạy: loại rotor SW 32Ti, loại ống Thinwall Ultra Clear 38,5mL, lực ly tâm: 100.000 x g, thời gian: 90 phút, nhiệt độ: 4ºC, gia tốc: maximum, giảm tốc: maximum.
• Tiến hành ly tâm: bật hút chân không (Open vent, Start vacuum), đợi cho đạt mức < 250 µL thì tiến hành chạy máy (Start).
• Khi kết thúc quá trình ly tâm, bơm chân không vào buồng máy ly tâm (Open vent), mở nắp máy và lấy rotor ra khỏi máy. Chuyển các adaptor vào tủ ATSH, sau đó dùng nhíp y tế gắp ống ly tâm ra khỏi adaptor và đặt ống vào giá đỡ.
• Trong lần ly tâm có thể tích môi trường lớn, sau khi kết thúc ly tâm thì hút loại bỏ dịch nổi và bổ sung tiếp dịch nuôi cấy tế bào chứa exosomes để ly tâm bằng chính ống ly tâm đó.
• Lặp lại theo đúng trình tự từ 1 đến 5 của Bước 4 này.
• Sử dụng ống ly tâm lặp lại tối đa 3 lần. Sau khi kết thúc ly tâm, tiến hành thu exosomes bằng cách bổ sung 500 – 1000 µL PBS 1X vào ống để đánh tan cặn exosomes và sau đó hút dịch chứa exosomes sang ống bảo quản. Tráng lại ống ly tâm bằng 200 – 500 µL PBS 1X tùy theo lượng môi trường ly tâm ban đầu. Hút dịch tráng lại và trộn đều với dịch exosomes lần đầu. Hỗn hợp dịch chứa exosomes này được gọi là dịch giàu exosomes.

Chú ý: Nhẹ nhàng sử dụng pipet serological (5mL hoặc 10 mL hoặc 25mL) từ từ hút dịch nổi cho đến khi thể tích dịch nổi trong ống cách cặn dưới đáy ống ly tâm còn 2 cm thì chuyển sang sử dụng pipet đơn kênh để hút bỏ toàn bộ dịch nổi sao cho cặn exosomes không bị bong khỏi đáy ống ly tâm (quan sát bằng mắt thường).

• Vệ sinh rotor SW32Ti cùng bộ adaptor và để bảo quản ở 4ºC.
• Sau mỗi lần ly tâm thì lưu lại dịch rửa exosomes để tiến hành xét nghiệm QC (vi khuẩn, nấm). Có thể trộn dịch rửa của nhiều ống vào một ống falcon sau đó hút 5mL dịch để tiến hành cấy khuẩn, nấm. Dịch còn lại sẽ được loại bỏ.
• Thực hiện xét nghiệm định danh vi khuẩn, nấm: Khoa xét nghiệm vi sinh, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec thực hiện xét nghiệm định danh vi khuẩn, nấm theo “Quy trình xét nghiệm vi khuẩn và nấm với hệ thống tự động” QX.VS.004.V1.0. 
• Dịch giàu exosomes được trích một phần nhỏ (khoảng 50 μL) đo nồng độ protein tổng số theo “Quy trình xác định protein tổng số trong thể tiết exosomes”.
• Pha loãng dịch giàu exosomes trong PBS 1X để đạt đến nồng độ quy định và chia vào các ống sản phẩm theo tiêu chí như sau:
  • Nồng độ protein tổng số: 100 – 150 µg/ mL
  • Số lượng tế bào tiết exosomes: 20 – 40 triệu tế bào cho 01 sản phẩm exosomes
  • Số lượng chai nuôi cấy tế bào: 2 – 4 chai T225 cho 01 sản phẩm exosome (hoặc số lượng chai kích thước khác quy đổi ra diện tích chai tương đương).
  • Số lượng tế bào nuôi cấy ở thời điểm thu môi trường phân lập exosomes và số lượng sản phẩm exosomes tuân theo đường chuẩn sau:

• Đóng gói sản phẩm chất tiết exosomes theo tiêu chí 01 sản phẩm gồm có:
  • 1 ống: chứa 2mL thể tiết exosomes/ ống
  • 1 ống: chứa 1mL thể tiết exosomes phá màng/ ống. Quy trình thực hiện phá màng exosomes (freeze – thaw cycle) được thực hiện theo bước 5.
  • Bảo quản các ống sản phẩm ở -86ºC.

5.6. Phá màng thể tiết Exosomes (Freeze – Thaw cycle)

• Chuẩn bị bể ổn nhiệt, đổ nước cất pha tiêm vào các ống của adaptor trong bể ổn nhiệt và set ở nhiệt độ 40ºC ít nhất 30 phút trước khi tiến hành phá màng, sau thời gian đó hạ nhiệt độ về 37ºC
• Chuẩn bị nitơ lỏng vào tank chuyên dụng.
• Đưa sản phẩm vào trong nitơ lỏng và đợi cho đến khi đóng băng toàn bộ sản phẩm, sau đó nhanh chóng chuyển qua bể ổn nhiệt 37 oC và đợi cho đến khi sản phẩm rã đông hoàn toàn. Thực hiện lặp lại chu kỳ đóng băng – rã đông này từ 10 – 15 lần.

Chú ý: Trong quá trình thực hiện, ống sản phẩm phải được để ngập trong nitơ lỏng và nước cất trong bể ổn nhiệt nhưng không được vượt quá nắp ống

• Sau khi thực hiện phá màng, chia sản phẩm vào các ống như tại mục 11 – Bước 4 (1mL/ống) và bảo quản ở -86ºC

6. Kiểm soát chất lượng

7. Xử lý mẫu và chất thải

• Phân loại, xử lý rác thải đúng nơi quy định
• Vệ sinh tất cả các thiết bị và bề mặt đã tiếp xúc

8. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

• Phiếu ly tâm điều chế sản phẩm thể tiết tế bào gốc trung mô (Exosomes)

Phụ lục 1

Tài liệu tham khảo

1. Bebelman, M.P., M.J. Smit, D.M. Pegtel, and S.R. Baglio, Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther, 2018. 188: p. 1-11.
2. Mathieu, M. and L. Martin-Jaular, Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol., 2019. 21(1): p.9-17, 10.1038/s41556-018-0250-9.
3. Raposo, G., & Stoorvogel, W. (2013). Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol, 200(4), 373-383

Từ viết tắt

• PBS: Phosphate Buffered Saline
• ATSH: An toàn sinh học
• MSCs: Mesenchymal stem cells
• AB: Apoptotic body
• MV: Microvesicles
• EX: Exosomes
• TTCNC: Trung tâm Công nghệ cao

Ghi chú: Văn bản được phát hành lần thứ 02, thay thế cho “Quy trình phân lập chất tiết ngoại bào (Exosomes) từ môi trường nuôi cấy tế bào trung mô dây rốn cho trẻ hóa da (không dùng cho tiêm – truyền)” phát hành ngày 09/03/2021. Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0