Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 17/01/2019 Ngày hiệu chỉnh: 18/03/2021

1. Mục đích 

Hướng dẫn cho chuyên viên, kỹ thuật viên Khối liệu pháp tế bào – Trung tâm Công nghệ cao thực hiện đúng quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và Lympho T.

2. Nguyên lý

• Dựa vào khác biệt giữa tỷ trọng của Ficoll và tế bào máu, tỷ trọng của Ficoll là 1,077 cao hơn tỷ trọng của bạch cầu lympho nhưng nó lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Vì vậy, khi ly tâm thì hồng cầu và bạch cầu hạt sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm, còn bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân khác nằm ở mặt trên lớp Ficoll.
• Sử dụng bộ Kit môi trường nuôi cấy đặc hiệu để nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và αβT có trong quần thể tế bào đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi người.

3. Định nghĩa

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi được định nghĩa là một hỗn hợp các dòng tế bào có một nhân bên trong máu ngoại vi, bao gồm bạch cầu đơn nhân, các tế bào lympho (NK, B, T) và các tế bào đại thực bào.

4. Thiết bị, vật tư tiêu hao, hóa chất nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và Lympho T

4.1. Hóa chất

• Bộ Kit nuôi cấy tế bào NK và tế bào Lympho T (αβΤ) đặc hiệu: BINKIT, hãng Cosmo, Nhật Bản:
  • NK/αβT Cell Initial Flask: Chai nuôi cấy sơ cấp đã được xử lý bề mặt đáy chai.
  • NK/αβT Cell Initial Medium: Môi trường nuôi cấy sơ cấp cho tế bào NK và tế bào αβT.
  • NK/αβT Cell Initial Cocktail: Cocktail cho nuôi cấy sơ cấp đã được bổ sung các yếu tố tăng trưởng chọn lọc chuyên biệt cho tế bào NK và αβT
  • NK/αβT Cell Subculture Medium: Môi trường nuôi cấy thứ cấp cho tế bào NK và tế bào αβT.
• Hóa chất khác: Dung dịch PBS 1X, Lymphoprep, thuốc nhuộm Turck…

4.2. Vật tư tiêu hao

• Vật tư sử dụng trong quy trình:
  • Chai nuôi cấy: 25cm2, 75cm2, 150cm2
  • Túi nuôi cấy: Nipro Culture Bag A-350NL, Nipro Culture Bag A-1000NL
  • Túi bảo quản tế bào sau nuôi cấy: Transfer bag 300ml
  • Ống ly tâm: 15ml, 50ml, 225ml
  • Pipet nhựa: 2ml, 5ml, 25ml, 50ml
  • Vật tư tiêu hao khác: Cell strainer, dây nối túi, buồng đếm tế bào,…

4.3. Thiết bị

• Trang thiết bị sử dụng trong quy trình:
  • Tủ an toàn sinh học cấp II, kính hiển vi soi ngược, tủ nuôi cấy tế bào, máy nối dây, máy hàn dây, tủ lạnh bảo quản hóa chất…

5. An toàn

• Đọc, hiểu quy trình và được đào tạo trước khi thực hiện quy trình.
• Người thực hiện cần được đào tạo về quy trình này trước khi thực hiện.
• Tuân thủ các hướng dẫn an toàn trong phòng thí nghiệm được quy định trong Sổ tay an toàn, mã số VNCV5.2-STAT của Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec và quy định về bảo đảm an toàn sinh học tại phòng xét nghiệm theo Nghị định 103/2016/NĐ-CP và thông tư 37/2017/TT-BYT.
• Tuân thủ các quy định về xử lý chất thải y tế được quy định trong thông tư liên tịch số 58/2015/TT-BYT-BTNMT, quy trình thực hiện phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ và xử lý chất thải rắn y tế, mã số 01418 của Bệnh viện Vinmec và quy định quản lý chất thải y tế, mã số 01409/JCI-PCI 7.2 7.3 của bệnh viện Vinmec.

6. Quy trình thực hiện

6.1. Loại mẫu

• Mẫu máu ngoại vi được đựng trong ống chống đông sodium lithium.

6.2. Chuẩn bị thực hiện quy trình

• Kiểm tra tình trạng hoạt động của các thiết bị sử dụng trong quy trình như mục 6.1. 
• Chuẩn bị hóa chất, vật tư trong quy trình đầy đủ như mục 6.2 và 6.3.

6.3. Các bước tiến hành

• Phân lập tế bào đơn nhân từ máu ngoại vi bằng phương pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng sử dụng Lymphoprep
  • Thu nhận huyết tương tự thân:

• • • Ly tâm máu ngoại vi với tốc độ 1710xg trong 10 phút ở nhiệt độ 20oC để thu huyết tương.
    • Huyết tương được bất hoạt ở 58C trong thời gian 60 phút.
    • Ly tâm tại độ 1710xg trong 5 phút ở nhiệt độ 20C để loại bỏ cặn.
    • Sử dụng 1ml huyết tương lưu trữ bảo tại -20C

• Phân lập tế bào đơn nhân:

• • Mẫu máu sau khi thu huyết tương được pha loãng với dung dịch PBS và chuyển nhẹ nhàng vào ống ly tâm 50ml đã sẵn Ficoll theo tỉ lệ thể tích (1:1)
  • Ly tâm ống mẫu với tốc độ 840xg trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ 20C.
  • Thu lớp tế bào đơn nhân ở giữa và chuyển sang ống ly tâm 50ml.
  • Bổ sung dung dịch PBS 1X tới 40ml vào ống ly tâm 50ml, trộn đều và ly tâm với tốc độ 640xg trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 20C.
  • Loại bỏ dịch nổi sau ly tâm và bổ sung thêm 20ml dung dịch PBS 1X. Trộn đều, rồi lấy 0,5ml để đếm số lượng tế bào.
  • Ly tâm mẫu với tốc độ 270xg trong 8 phút ở nhiệt độ 20C để thu tế bào đơn nhân chuẩn bị cho bước nuôi cấy.

• Xác định số lượng tế bào đơn nhân phân lập được bằng phương pháp đếm tế bào:

• • Nhuộm với thuốc nhuộm Turck theo tỷ lệ thể tích (1:1).
  • Hút 10µl hỗn hợp và nhả vào buồng đếm dùng một lần
  • Đếm các tế bào bắt màu và rồi tính số lượng tế bào.

• Nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và αβT

• • Nuôi cấy sơ cấp tế bào NK và αβT từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi:
  • Chuẩn bị chai nuôi cấy sơ cấp: Chai nuôi cấy sơ cấp dành cho tế bào NK/αβT được rửa 3 lần với dung dịch PBS 1X (10ml/1 lần).

• Chuẩn bị môi trường nuôi cấy sơ cấp cho tế bào NK (hoặc αβT):

• • Mật độ tế bào: D=1×106 tế bào/ml
  • Huyết tương tự thân được bổ sung theo tỉ lệ thể tích là 5% so với môi trường nuôi cấy sơ cấp
  • Bổ sung Initial Cocktail cho tế bào NK (hoặc αβT) theo tỉ lệ là 40µl/1ml môi trường sơ cấp.

• Tế bào đơn nhân được hòa đều trong môi trường nuôi cấy sơ cấp
• Quan sát tế bào dưới kính hiển vi.
• Đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 37oC với 5% CO2 trong 72 giờ.

• Nuôi cấy thứ cấp tế bào NK và αβT:

• Thay môi trường nuôi cấy sơ cấp:

• • Thu dịch huyền phù tế bào nuôi cấy và tiến hành ly tâm với tốc độ 270xg trong 8 phút ở nhiệt độ 20oC. Loại bỏ phần dịch nổi sau ly tâm.
  • Hòa đều khối tế bào vào môi trường nuôi cấy thứ cấp bổ sung tỷ lệ huyết tương tự thân phù hợp với mật độ D = 0.6 x106 – 3.0 x 106 tế bào/ml.
  • Cho toàn bộ dung dịch tế bào vào chai nuôi cấy thông thường.
  • Đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 37oC với 5% CO2.
  • Kiểm tra và bổ sung môi trường nuôi cấy thứ cấp 2-3 ngày/lần, phụ thuộc vào tốc độ tăng sinh của tế bào.

• Tế bào NK (hoặc αβT) được nuôi cấy trong vòng 14-21 ngày

• Thu nhận tế bào NK (hoặc αβT) sau nuôi cấy:
  • Trước khi thu hoạch, tế bào được lấy mẫu thực hiện xét nghiệm vi khuẩn, vi nấm và phân tích marker bề mặt.
  • Chuyển toàn bộ dịch huyền phù tế bào nuôi cấy vào các ống ly tâm 225ml và tiến hành ly tâm thu tế bào với 270xg trong thời gian 8 phút ở nhiệt độ 20oC.
  • Rửa tế bào 2 lần với dung dịch PBS 1X.
  • Xác định số lượng và tỷ lệ sống của tế bào:

• Dung dịch PBS có chứa tế bào được nhuộm với Trypan Blue theo tỉ lệ thể tích (1:1).
• Đếm số lượng tế bào sống và tế bào chết để xác định được số lượng tế bào, cũng như tỷ lệ tế bào sống.

• Chuẩn bị dịch truyền tế bào:

• • Chuẩn bị 70ml dung dịch Ringer Lactate có 0,5% human albumin.
  • Tế bào sau khi rửa với dung dịch PBS 1X được hòa đều trong dung dịch Ringer lactate đã chuẩn bị.
  • Dung dịch tế bào được lọc qua màng lọc vô khuẩn có kích thước 70µm.
  • Chuyển toàn bộ 70ml dịch tế bào sau khi lọc vào túi truyền dịch.
  • Bảo quản mẫu ở 4C và truyền trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tế bào.
  • Lưu trữ sản phẩm truyền được cắt ra từ đoạn đầu túi truyền ở 4C.

7. Kiểm soát chất lượng

• Chất lượng tế bào được kiểm soát chất lượng bởi các xét nghiệm sau:
  • Tỷ lệ sống của tế bào.
  • Kết quả xét nghiệm cấy tìm vi nấm và vi khuẩn
  • Kết quả xét nghiệm Mycoplasma.
  • Kết quả xét nghiệm nội độc tố – Endotoxin
  • Tốc độ tăng sinh tế bào NK và αβT
• Nhận định kết quả:
  • Tỷ lệ sống của tế bào >80%
  • Kết quả xét nghiệm cấy tìm vi nấm và vi khuẩn: âm tính
  • Kết quả xét nghiệm Mycoplasma: âm tính
  • Kết quả xét nghiệm nội độc tố – Endotoxin: <0.5 EU/ml
  • c độ tăng sinh tế bào NK và αβT đạt ít nhất 60 lần.
• Yêu cầu về mẫu/sản phẩm
  • Tiêu chuẩn nhận mẫu/sản phẩm

• • • Mẫu được đựng trong ống chống đông sodium lithium.
    • Ống đựng mẫu còn nguyên trạng thái vô khuẩn như nắp kín, không bị rò rỉ, tràn đổ.
    • Mẫu máu không bị đông hay vón cục và đủ thể tích.
    • Mẫu máu ngoại vi được bảo quản ở 15oC đến 25oC trong thời gian chờ xử lý nuôi cấy tế bào.
    • Mẫu tế bào sau khi thu hoạch được bảo quản ở 4oC và truyền trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tế bào
    • Mẫu huyết tương được lưu trữ tại -20 oC
    • Mẫu sản phẩm tế bào được lưu trữ tại 4oC

• • Tiêu chuẩn hủy mẫu, sản phẩm

• • • Mẫu không đạt một trong các tiêu chuẩn nhận mẫu
    • Mẫu huyết tương và sản phẩm tế bào lưu trữ được hủy sau thời gian 45 ngày kể từ ngày thu thập máu ngoại vi.

8. Xử lý mẫu, dụng cụ và chất thải

• Tuân thủ các quy định về xử lý chất thải y tế được quy định trong thông tư liên tịch số 58/2015/TT-BYT-BTNMT và Quy trình thực hiện phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ và xử lý chất thải rắn y tế, mã số 01418 của Bệnh viện Vinmec và Quy định quản lý chất thải y tế, mã số 01409/JCI-PCI 7.2 7.3 của bệnh viện Vinmec.
• Tuân thủ các quy định về an toàn trong Sổ tay an toàn, mã số VNCV5.2-STAT.

9. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

• Lưu đồ quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và lympho T
• Danh mục hóa chất, thuốc và vật tư tiêu hao sử dụng trong quy trình
• Danh mục các bước thực hiện trong quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và Lympho T
• Phiếu nhận mẫu thực hiện dịch vụ nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch
• Phiếu kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch NK
• Phiếu kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch Lympho T
• Phiếu thông tin nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch NK
• Phiếu thông tin nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch Lympho T

Tài liệu tham khảo

1. Guideline for cell culturing using medium kit BINKIT, Biotherapy Institute of Japan Ltd
2. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by density gradient centrifugation, Miltenyl Biotec Inc. (2008) www.mitenylbiotec.com.
3. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Min Cheng, Yongyan Chen, Weihua Xiao, Rui Sun and Zhigang Tian. Cellular & Molecular Immunology. (2013) 10:230–252.

Từ viết tắt

• αβΤ: Alpha Beta Lympho T
• NK: Natural Killer
• PBS: Phosphate-buffered saline

Phụ lục 1. Lưu đồ quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và lympho T (PDF) Phụ lục 2. Danh mục hóa chất, thuốc và vật tư tiêu hao sử dụng trong quy trình Phụ lục 3. Danh mục các bước thực hiện trong quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và Lympho T Phụ lục 4. Phiếu nhận mẫu nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch Phụ lục 5. Phiếu kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch NK Phụ lục 6. Phiếu kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch Lympho T Phụ lục 7. Phiếu thông tin nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch NK Phụ lục 8. Phiếu thông tin nuôi cấy tăng sinh tế bào miễn dịch Lympho T Ghi chú: Văn bản được phát hành lần thứ hai thay thế văn bản “Quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào NK và Lympho T” (mã số 01966/30) phát hành ngày 17/01/2019. Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0