Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 22/11/2019 Ngày hiệu chỉnh: 13/03/2021

1. Mục đích 

Hướng dẫn các chuyên viên và kỹ thuật viên làm việc tại Trung tâm Công nghệ cao (TT CNC) thực hiện đúng kỹ thuật phân lập, nuôi cấy, và lưu trữ tế bào gốc trung mô từ mô mỡ.

2. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

• Phân đoạn mạch nền (Stromal Vascular Fraction – SFV) là một hỗn hợp tế bào không đồng nhất (heterogenous) thu được sau khi phân tách mô mỡ bằng enzyme sau đó ly tâm để loại bỏ phần tế bào mỡ. SVF bao gồm các tế bào nội mô (endothelial cells), nguyên bào sợi (fibroblasts), hồng cầu (erythrocytes), tế bào bạch cầu, đại thực bào (macrophages), tế bào quanh mạch (pericytes) và quan trọng nhất là tế bào gốc trung mô.
• Tế bào gốc trung mô (Mensenchymal Stem Cells) từ mô mỡ (Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell – AD-MSC) có những tính chất giống với các loại tế bào gốc MSC từ những nguồn khác như khả năng bám dính, tăng sinh trong môi trường nuôi cấy in vitro và khả năng đa biệt hóa thành các tế bào mô liên kết (mô mỡ, sụn, hay tế bào tạo xương).

3. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất để phân lập, nuôi cấy và lưu trữ tế bào gốc trung mô từ mô mỡ

3.1. Thiết bị

3.2. Vật tư tiêu hao

Ghi chú: Trong trường hợp bắt buộc, có thể thay thế các vật tư tiêu hao trên bằng các vật tư khác cùng chất lượng và chức năng tương tự.

3.3. Hóa chất

Ghi chú: Trong trường hợp bắt buộc, có thể thay thế các vật tư tiêu hao trên bằng các vật tư khác cùng chất lượng và chức năng tương tự.

4. An toàn

• Người thực hiện quy trình này có nghĩa vụ phải đọc, hiểu quy trình trước khi tiến hành thực hiện.
• Thực hiện chính xác các quy định về đồ bảo hộ cá nhân và các biện pháp an toàn khi thực hiện quy trình theo quy định của TT CNC.
• Đảm bảo các quy trình phải được thực hiện đúng, chính xác và đầy đủ.

5. Quy trình kỹ thuật thực hiện

5.1. Yêu cầu về mẫu

• Tiêu chuẩn nhận mẫu:

• • • Mẫu phải có đầy đủ thông tin bệnh nhân.
    • Mẫu còn nguyên tình trạng vô khuẩn, lọ đựng mẫu kín, không bị rò rỉ, tràn đổ.
    • Kích thước mẫu tối thiểu đạt 2 x 1 x 1,5 cm hoặc khối lượng mẫu tối thiểu đạt 3g (không bao gồm phần da).
    • Mẫu đã thu thập có thể được bảo quản trong vòng 24 giờ ở đúng điều kiện (nhiệt độ 2-8°C) trước khi chờ xử lý.

• Tiêu chuẩn loại mẫu:

• • Lọ đựng mẫu bị hở, rò rỉ, tràn đổ.
  • Kích thước mẫu nhỏ hơn 2 x 1 x 1,5 cm hoặc khối lượng nhỏ hơn 3g.
  • Mẫu được thu thập quá 24 giờ, không được bảo quản đúng điều kiện (nhiệt độ 2-8°C).

5.2. Quy trình thực hiện

• Lưu ý chung: Tủ an toàn sinh học phải được khử trùng theo quy định của TT CNC bằng cồn trước, trong, và sau khi sử dụng. Các hóa chất và vật tư phải được kiểm tra bao bì, tính vô trùng, khử trùng, khử khuẩn (xịt cồn 70%) trước khi sử dụng và trước khi đưa vào tủ an toàn sinh học.
• Bước 1: Xử lý bề mặt chai nuôi cấy
  • Pha loãng cơ chất phủ bề mặt (CellSTART) bằng dung dịch PBS 1X ở tỉ lệ pha loãng 1:100 (có thể thay đổi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy).
  • Phủ hoàn toàn bề mặt chai nuôi cấy với các mức dung dịch như sau:

• Ủ chai nuôi cấy có chứa chất phủ bề mặt ở 37oC tại tủ nuôi cấy tế bào trong 1-2 giờ. Sau khi ủ, chai nuôi cấy có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC với nắp khóa chặt trong vòng 3 ngày.
• Bước 2: Phân tách mô mỡ
  • Bật máy ủ nhiệt có lắc Adi Plus ở 37oC để ủ mẫu
  • Chuẩn bị 25ml dung dịch HBSS chứa Collagenase 200U/ml:

• • • Dùng serological pipette 25ml hút 24,5ml HBSS vào ống ly tâm 50ml.
    • Sau đó, dùng micropipette bổ sung 500µl dung dịch stock Collagenase có nồng độ 10.000U/ml và 125µl Human albumin 200g/l để đảm bảo nồng độ cuối là 200U/ml Collagenase và 0,1% Human albumin cho dung dịch. Hòa trộn đều.

• Cân mẫu bằng cân điện tử, ghi nhận khối lượng mẫu.
• Rửa mẫu mô mỡ 3 – 4 lần với 25ml HBSS trong ống ly tâm 50ml cho đến khi sạch, trong, không còn màu hồng.
• Sau khi mô mỡ được rửa sạch, dùng dao và kéo loại bỏ mạch máu, mô liên kết và lớp da còn sót lại. Cắt nhỏ mẫu mô thành các miếng nhỏ 3-4mm.
• Trộn đều mẫu đã cắt nhỏ với HBSS chứa Collagenase 200U/ml và 0,1% Human albumin đã chuẩn bị ở mục 2. Ủ ấm ở 37oC trong 1 giờ trong máy Adi Plus với tốc độ lắc 300 vòng/phút.
• Kiểm tra quá trình xử lý. Xử lý thành công khi mô mỡ chuyển thành dạng lỏng, mịn, mượt.
• Dùng serological pipet, nhẹ nhàng hút phần dịch nổi dưới lớp mỡ ở trên cùng, lọc mẫu qua cell strainer 70µm.
• Ly tâm với tốc độ 500 g trong 10 phút ở 15-20oC.
• Hút loại bỏ phần mỡ nổi ở trên và HBSS chứa collagenase, để lại 2-3 ml HBSS chứa cặn ở ống ly tâm.
• Thêm 10ml môi trường nuôi cấy vào mỗi phần cặn, hòa trộn đều và chuyển sang ống ly tâm 15ml.
• Ly tâm với tốc độ 500 g trong 5 phút ở 15-20oC.
• Hút loại bỏ phần dung dịch ở trên, để lại 2-3 ml dung dịch ở đáy ống. Hòa tan cặn với 10ml môi trường nuôi cấy và chuyển sang ống ly tâm 15ml mới.

• Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào
  • Mỗi loại môi trường thương mại hay bộ kit thương mại sẽ bao gồm: 01 dung dịch nuôi cấy nền (Basal medium) và 01 dung dịch chất tăng sinh bổ sung (Supplement).
  • Pha môi trường theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
  • Bổ sung 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) khi nuôi cấy AD-MSC mới phân lập. Từ khoảng ngày 3 tới ngày 5 sau phân lập, thay thế dần dần môi trường bằng môi trường không chứa kháng sinh.

Ghi chú: Môi trường phải được ủ ấm đến nhiệt độ 37oC trong bể ổn nhiệt ít nhất 20 phút trước khi sử dụng để nuôi cấy.

• Bước 4: Nuôi cấy tế bào AD-MSC
  • Phân mạch đoạn nền (SVF) sau khi ly tâm sẽ được hoà nhẹ nhàng với 10ml dung dịch nuôi cấy.
  • Lấy 10 µl tế bào trộn với 10 µl dung dịch nhuộm Turck, đếm tế bào bằng Hemacytometer.
  • Tiến hành rửa chai nuôi cấy đã xử lý bề mặt với chất phủ bằng cách hút toàn bộ dung dịch chứa chất phủ bề mặt và rửa chai với dung dịch PBS theo hướng dẫn bên dưới tùy theo từng diện tích bề mặt nuôi cấy.

• Hút bỏ dung dịch PBS và thay thế bằng lượng dung dịch nuôi cấy như bảng bên dưới rồi chuyển các chai nuôi cấy này vào bên trong tủ nuôi cấy.

• Sau khi đếm tế bào, ly tâm tế bào với tốc độ 500g trong vòng 5 phút.
• Hoà tế bào nhẹ nhàng trong dung dịch nuôi cấy với thể tích phù hợp để đạt được thể tích nuôi cấy cuối cùng trong chai theo bảng sau:

• Chuyển tế bào vào trong chai nuôi cấy đã được chuẩn bị.
• Chuyển các chai nuôi cấy có chứa tế bào vào tủ nuôi cấy có nhiệt độ 37oC, 5% CO2.
• Kiểm tra khả năng bám dính tế bào 24h sau khi cấy chuyển.
• Thay mới môi trường 48-72h sau khi phân lập bằng cách hút bỏ môi trường cũ và bổ sung môi trường mới.

Ghi chú: Nếu cần thiết, thay môi trường 3 ngày 1 lần cho tới khi mật độ tế bào đạt 70% – 80% độ phủ bề mặt và tiến hành cấy chuyển

• Bước 5: Cấy chuyển AD-MSC bằng phương pháp enzyme
  • Trước khi tiến hành cấy chuyển, cần chuẩn bị xử lý bề mặt chai nuôi cấy như hướng dẫn ở bước 1. Tỉ lệ pha loãng là 1:300 (CellSTART: PBS 1X)
  • Làm ấm môi trường nuôi cấy trong bể ổn nhiệt được cài đặt ở nhiệt độ 37oC ít nhất 20 phút trước khi tiến hành cấy chuyển.

Ghi chú: Không ủ ấm quá 2 tiếng trong bể ổn nhiệt để tránh ảnh hưởng đến hoạt chất của các chất tăng sinh tế bào (growth factors).

•  Rửa chai tế bào đã xử lý phủ bề mặt bằng dung dịch PBS theo bảng sau:

• Hút bỏ PBS và thêm dung dịch nuôi cấy tế bào đã ủ ấm theo bảng dưới đây, sau đó chuyển chai nuôi cấy vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 độ C:

• Bắt đầu tiến hành quy trình cấy chuyển tế bào AD-MSCs bằng việc quan sát tế bào dưới kính hiển vi và lưu trữ hình ảnh của tế bào trước khi cấy chuyển.
• Hút bỏ dung dịch nuôi cấy trong chai nuôi cấy sau đó rửa lại bề mặt chai nuôi cấy bằng dung dịch PBS theo bảng hướng dẫn bên dưới.

Ghi chú: Bổ sung dung dịch PBS bằng cách sử dụng serological pipette và hướng dung dịch vào cạnh bên của chai nuôi cấy.

• Hút hoàn toàn dung dịch PBS và thêm vào chai nuôi cấy dung dịch Enzyme TryPLE Select theo hướng dẫn bên dưới:

• Ủ tế bào với TryPLE Select trong tủ nuôi cấy ở 37oC trong khoảng 3-5 phút (nếu cần thiết có thể tăng thời gian ủ mẫu, tuy nhiên không được vượt quá 8 phút).
• Vỗ nhẹ cạnh bên của chai nuôi cấy để tế bào rời khỏi bề mặt chai nuôi cấy, quan sát nhanh dưới kính hiển vi nếu cần thiết.
• Trung hoà hoạt tính của enzyme bằng cách thêm vào dung dịch nuôi cấy với thể tích theo bảng sau:

• Hút nhả bằng serological pipette (từ 3-5 lần) để thu toàn bộ tế bào sau khi xử lý bằng enzyme và chuyển vào ống ly tâm thích hợp.
• Tiến hành đếm tế bào bằng cách lấy 10µl dung dịch tế bào và trộn đều với 10µl Trypan Blue. Đếm tế bào bằng hemocytometer.

Số lượng tế bào = Số lượng tế bào trung bình sau đếm × Hệ số pha loãng × 104 × Thể tích dung dịch

• Ly tâm với tốc độ 400 g trong vòng 4 phút 15-20C
• Thêm dung dịch có chứa tế bào với thể tích thích hợp vào chai nuôi cấy đã được xử lý bề mặt để đạt được mật độ mong muốn. Tổng thể tích cần cho 1 chai T75 là 15ml và chai T225 là 35 ml. Lắc nhẹ để tế bào phân tán đều trên bề mặt chai nuôi cấy.
• Chuyển chai nuôi cấy vào tủ nuôi cấy tế bào ở nhiệt độ 37C và 5% CO2.
• Nếu cần, thay môi trường 3 ngày/lần cho đến khi tế bào đạt độ phủ bề mặt từ 70% – 80% cho lần cấy chuyển kế tiếp hoặc cho đông lạnh lưu trữ tế bào.

• Bước 6: Lưu trữ AD-MSC
  • Tại thời điểm cấy chuyển (P0 và P1), thu hoạch tế bào theo quy trình cấy chuyển bằng enzyme sau đó đếm tế bào và hoà tan tế bào với dung dịch Cryostor để đạt mật độ 1-3 triệu tế bào/ml.
  • Phân chia tế bào vào ống đựng mẫu (Cryotube) với mật độ 1-3 triệu tế bào/ml/vial.
  • Để các vial vào hộp hạ nhiệt tế bào hoặc máy hạ nhiệt tự động và thực hiện theo quy trình hướng dẫn.
  • Khi tế bào đạt -80C, chuyển tế bào vào hệ thống lưu trữ tế bào tự động Brooks đúng theo vị trí quy định và ghi nhận vị trí lưu trữ trên hệ thống.

6. Kiểm soát chất lượng

• Xét nghiệm cấy nấm, cấy khuẩn được thực hiện ở mẫu dung dịch vận chuyển mô mỡ và dịch rửa tế bào SVF sau khi xử lý.
• Xét nghiệm cấy nấm, cấy khuẩn được thực hiện ở mẫu chứa môi trường nuôi cấy tế bào ở thời điểm lưu trữ tế bào.
• Xét nghiệm Mycoplasma được thực hiện ở mẫu dịch rửa tế bào SVF sau xử lý và môi trường nuôi cấy tại thời điểm lưu trữ tế bào.
• Xét nghiệm kiểm tra đặc tính tế bào MSC (Flow cytometry) ở passage 2.
• Xét nghiệm kiểm tra karyotype ở passage 3.
• Lưu trữ tế bào tại P0 và P1 bằng dung dịch Cryostor.

7. Xử lý mẫu và chất thải

7.1. Xử lý mẫu bị nhiễm

• Trong quá trình nuôi cấy, từ ngày D6 trở đi không còn sử dụng kháng sinh vì thế việc nhiễm khuẩn trong khi thực hiện quy trình có thể xảy ra.
• Các đặc điểm khi mẫu nhiễm khuẩn:
  • Màu dung dịch nuôi cấy chuyển sang màu vàng.
  • Dung dịch nuôi cấy vẩn đục, nặng mùi.
  • Quan sát trên kính hiển vi phát hiện có vi khuẩn hoặc nấm.
• Khi quan sát mẫu có những đặc điểm trên, cần thực hiện các bước sau:
  • Khóa chặt nắp chai bị nhiễm
  • Cách ly chai bị nhiễm với những vật dụng khác bằng cách bỏ chai bị nhiễm vào túi Zip hoặc túi rác vàng và chuyển ra khu vực dành riêng cho các mẫu bị nhiễm.
  • Toàn bộ hóa chất đã sử dụng cho mẫu nhiễm cũng được cho vào túi Zip hoặc túi rác vàng và chuyển ra khu vực dành cho các mẫu bị nhiễm.
  • Báo cáo cho quản lý trực tiếp của mình, quản lý chất lượng, xin phương hướng xử lý mẫu nhiễm và toàn bộ hóa chất liên quan.
  • Tiến hành tổng vệ sinh tủ an toàn sinh học cấp 2 đã sử dụng, lau toàn bộ bề mặt tủ an toàn sinh học bằng chất sát khuẩn 2 lần và lau lại 3 lần bằng cồn 70. Sau đó bật đèn UV theo chương trình của tủ an toàn sinh học.

7.2. Dụng cụ và chất thải

• Vệ sinh toàn bộ bề mặt tủ an toàn sinh học bằng dung dịch khử khuẩn và cồn 70.
• Đóng tủ an toàn sinh học và bật đèn cực tím.
• Vệ sinh tất cả các thiết bị và bề mặt đã tiếp xúc như máy ly tâm đã sử dụng, máy tính, mặt bàn, mặt tủ.

8. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

• Lưu đồ thực hiện Quy trình cấy tế bào gốc từ mô mỡ – Dịch vụ
• Phiếu xử lý mô mỡ

Tài liệu tham khảo

1. Aghayan HR., Goodarzi P., Arjmand B. (2014) GMP-Compliant Human Adipose TissueDerived Mesenchymal Stem Cells for Cellular Therapy. In: Turksen K. (eds) Stem Cells and Good Manufacturing Practices. Methods in Molecular Biology, vol 1283. Humana Press, New York, NY.
2. Oberbauer, E., et al. (2015). “Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art.” Cell Regen (Lond) 4: 7.
3. Haahr MK, et al. Safety and Potential Effect of a Single Intracavernous Injection of Autologous Adipose-Derived Regenerative Cells in Patients with Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy: An Open-Label Phase I Clinical Trial. EBioMedicine. 2016 Mar; 5:204–10.
4. Frese L, Dijkman PE, Hoerstrup SP. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfus Med Hemother. 2016 Jul;43(4):268–74.

Từ viết tắt

• Ad-MSC: Adipose-derived mesenchymal stem cells
• HBSS: Hank’s Balanced Salt Solution
• PBS: Phosphate Buffer Saline
• SVF: Stromal Vascular Fraction

Ghi chú: Văn bản được phát hành lần thứ hai thay thế văn bản “Quy trình kỹ thuật phân lập, nuôi cấy và lưu trữ tế bào gốc trung mô từ mô mỡ” (mã số VMEC_CN13) phát hành ngày 22/11/2019. Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0