Người thẩm định: Hội đồng khoa học Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Người phê duyệt: Viện trưởng Viện Ứng dụng Y học tái tạo
Ngày phát hành: 26/08/2021

1. Mục đích

• Hướng dẫn cho nhân viên Khối di truyền y học thực hiện kỹ thuật định lượng DNA bằng phương pháp Real Time PCR 
• Nhằm đảm bảo tính nhất quán và giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện.

2. Nguyên lý

• Quy trình xét nghiệm Realtime PCR được sử dụng để phát hiện các bất thường số lượng bản sao của đoạn trình tự DNA quan tâm trong hệ gen người.
• Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân bản đoạn gen quan tâm trong hệ gen theo nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR.
• Chất phát huỳnh quang SYBR Green được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Khi DNA sợi đôi được tạo thành, SYBR Green sẽ bám vào và phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích.
• Số lượng bản sao trong genome càng nhiều lượng DNA tạo ra càng lớn và do đó tín hiệu huỳnh quang thu được càng cao.
• Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng trên mẫu bệnh nhân và mẫu chuẩn được thu nhận, xử lý và so sánh theo thời gian thực trong suốt quá trình phản ứng PCR diễn ra để xác định số lượng bản sao của vùng gen quan tâm.

3. Định nghĩa và các khái niệm liên quan

Real-time PCR – Real-time Polymerase Chain Reaction: Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực là kỹ thuật sinh học phân tử mà quá trình khuếch đại DNA được theo dõi trong suốt quá trình phản ứng.

4. Thiết bị/vật tư tiêu hao/hóa chất định lượng DNA

4.1. Thiết bị

4.2. Vật tư tiêu hao

4.3. Hóa chất

5. An toàn

• Nhân viên thực hiện mang trang bị bảo hộ khi làm việc theo SOP-VNC-59.
• Tuân thủ theo đúng các hướng dẫn an toàn phòng xét nghiệm
• Tuân thủ đúng hướng dẫn của quy trình này
• Xử lý rác thải theo SOP-VNC-62

6. Quy trình kỹ thuật thực hiện định lượng DNA

6.1. Loại mẫu

• Mẫu máu ngoại vi
• Mẫu dịch ối
• Mẫu sinh thiết gai nhau
• Mẫu tế bào sau nuôi cấy (tế bào ối, gai nhau, tế bào gốc)

6.2. Tiếp nhận mẫu

QTKT08

6.3. Chuẩn bị thực hiện quy trình

• Chuẩn bị biểu mẫu, sơ đồ vị trí các giếng phản ứng trên đĩa phản ứng.
• Chuẩn bị trang thiết bị, hóa chất, vật tư theo danh sách
• Rã đông hóa chất theo hướng dẫn từng bước
• Làm sạch khu vực thí nghiệm bằng cồn 70 độ 2 lần

6.4. Các bước tiến hành

6.4.1. Tách chiết DNA tổng số

• DNA được tách chiết từ mẫu phẩm theo QTKT 02.
• Độ tinh sạch và nồng độ của DNA sau tách chiết được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng của DNA, sử dụng máy NanoDrop
• Nồng độ của DNA sau tách chiết nằm trong khoảng 20-200 ng/μl được coi là đạt.
• Tỉ lệ độ hấp thụ đo được tại bước sóng 260 và 280 nm (A260/A280) nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 thì DNA thu hồi được coi là tinh sạch.

6.4.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng của cặp mồi

6.4.2.1. Pha loãng DNA Reference (Mẫu chứng) từ ống lưu DNA gốc

• Mẫu DNA Reference ( Mẫu chứng) là DNA tổng số tách chiết từ mẫu phẩm của người cho khỏe mạnh không mang bất thường về kiểu gen và kiểu hình đang xét.
• Tính toán tổng lượng DNA cần thiết cho toàn bộ quy trình.
• Tiến hành pha loãng DNA Reference vào các ống Effpendorf 1.5 ml về các nồng độ theo bảng bên dưới. Lưu ý pha loãng mẫu từ nồng độ cao nhất đến thấp dần với tỷ lệ pha loãng 10 lần mỗi lần pha.

• Mix đều các ống mẫu và thay đầu tip mới sau mỗi bước pha loãng.
• Các ống mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20ºC.

6.4.2.2. Mix các thành phần phản ứng

• Rã đông các ống mồi và ống DNA mẫu tại nhiệt độ phòng trong 15 phút.
• Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm các thành phần như sau:

• Mix đều hỗn hợp bằng máy Voltex trong 15 giây. Spin nhẹ.
• Chia vào mỗi giếng phản ứng 15 μl hỗn hợp phản ứng vào các giếng phản ứng theo sơ đồ đã chuẩn bị.
• Thêm vào mỗi giếng phản ứng 5 μl mẫu DNA Reference đã chuẩn bị ở trên theo sơ đồ. Mẫu âm tính Negative Control được tiến hành với 5 μl H₂O .
• Lưu ý các giếng phản ứng cho 1 lần tối ưu hóa được đặt dọc theo một cột. Mỗi cặp mồi tiến hành 2 lần lặp lại phản ứng.
• Ví dụ sơ đồ bố trí cho một cặp mồi MECP như sau:

• Dán bề mặt đĩa phản ứng bằng phim nhựa quang chuyên dụng cho Real-time PCR.
• Mix đều bằng máy Voltex. Spin nhẹ.

6.4.2.3. Tiến hành phản ứng và ghi tín hiệu trên máy 7500 Real Time PCR System

• Mở máy tính và máy 7500 Real Time PCR Systems.
• Mở phần mềm 7500 Software v2.3.
• Mở New experiment và cài đặt mới chương trình chạy theo các chỉ dẫn/thông số như sau:
  • Experiments Properties: 
    • 7500 (96 wells)
    • Quantitation-Relative Standard Curve
    • SYBR Green Reagents
    • Standard (~2 hours to complete a run)
  • Plate setup > Define Target and Sample: Đặt tên cho mẫu và tên mồi như đã setup ở trên.
  • Plate setup > Assign Target and Sample > Chọn tên mồi và mẫu cho các giếng phản ứng.
  • Plate setup > Assign Target and Sample > Define the standard curve:
    • # Point: 4
    • # Replicate: 2
    • # Starting quantity: 100
    • #Serial dilution: 1:10
  • Plate setup > Assign Target and Sample > Define the standard curve > Select and Arange well:
    • Let me select wells
    • Rows
  • Plate setup > Assign Target and Sample > Select relative quantitation settings:
    • Reference Sample: M100
    • Endogenous Control: Multiple Control
  • – Run Method: 
    • Reaction volume: 20 μl
    • Kiểm tra chu trình nhiệt:

• Lưu file đã cài đặt vào ổ đĩa máy tính ổ D > Folder Validation > XNG-66.
• Đặt đĩa phản ứng vào máy 7500 Real Time PCR Systems, đóng máy và ấn Start run.
• Sau khi máy chạy và ghi tín hiệu, kết quả được lưu dưới dạng file.eds và được đọc bằng phần mềm 7500 Software v2.3.

6.4.2.4. Phân tích kết quả để xác định mồi có tối ưu cho phân tích bệnh phẩm

• Dựa vào đường chuẩn (standard curve), nếu 4 điểm giá trị CT của 4 nồng độ mẫu chứng cùng nằm trên hoặc gần giá trị đường chuẩn thẳng, mồi được coi là tối ưu để dùng phân tích trên mẫu bệnh nhân.
• Nếu mồi tối ưu, thực hiện phân tích trên mẫu bệnh ở nồng độ DNA là 2ng/μl.
• Ví dụ một đường chuẩn được thể hiện trong hình bên dưới:

6.4.3. Tiến hành phản ứng và phân tích trên mẫu bệnh phẩm

6.4.3.1. Pha loãng DNA tổng số từ ống lưu DNA gốc

• Tính toán số phản ứng và tổng lượng DNA cần thiết (DNA bệnh nhân và DNA Reference) cho các phản ứng theo bảng sau:

• Tiến hành pha loãng DNA Reference và DNA bệnh nhân về nồng độ 2ng/μl
• Cặp mồi nội chuẩn là RPPH1.
• Mix đều các ống mẫu sau mỗi bước pha loãng.
• Các ống mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -20oC.

6.4.3.2. Mix các thành phần phản ứng

• Rã đông các ống mồi và ống DNA tại nhiệt độ phòng trong 15 phút.
• Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng gồm các thành phần như sau:

• Mix đều hỗn hợp bằng máy Voltex trong 15 giây. Spin nhẹ.
• Chia vào mỗi giếng phản ứng 15 μl hỗn hợp phản ứng vào các giếng phản ứng theo sơ đồ đã chuẩn bị.
• Thêm vào mỗi giếng phản ứng 5 μl các mẫu DNA đã chuẩn bị ở trên theo sơ đồ. Mẫu âm tính Negative Control (NC) được tiến hành với 5 μl H2O.
• Lưu ý các giếng phản ứng cho mỗi bệnh nhân được đặt dọc theo một cột, mỗi bệnh nhân 3 cột (lặp 3 lần). Các phản ứng cho mỗi cặp mồi được bố trí theo hàng ngang.
• Ví dụ sơ đồ bố trí cho 3 cặp mồi (DMD E12, E15, E16) cho 2 bệnh nhân (Vinh, Quang) :

• Dán bề mặt đĩa phản ứng bằng phim nhựa quang chuyên dụng cho Real-time PCR.
• Mix đều bằng máy Voltex. Spin nhẹ.

6.4.3.3. Tiến hành phản ứng và ghi tín hiệu trên máy 7500 Real Time PCR System

• Mở máy tính và máy 7500 Real Time PCR Systems.
• Mở phần mềm 7500 Software v2.3.
• Mở New experiment và cài đặt chương trình chạy theo các chỉ dẫn/thông số như sau:
  • Experiments Properties: + 7500 (96 wells)
    • Quantitation Comparative (ΔΔCT)
    • SYBR Green Reagents
    • Standard (~2 hours to complete a run)
  • Plate setup > Define Target and Sample: Đặt tên cho mẫu và tên mồi như đã setup ở trên.
  • Plate setup > Assign Target and Sample > Chọn tên mồi và mẫu cho các giếng phản ứng.
  • Plate setup > Assign Target and Sample > Select relative quantitation settings:
    • Reference Sample: Ref
    • Endogenous Control: RPPH1
  • – Run Method:
    • Reaction volume: 20 μl
    • Kiểm tra chu trình nhiệt:

• Lưu file đã cài đặt vào ổ đĩa máy tính ổ D > Folder Validation > XNG-66.
• Đặt đĩa phản ứng vào máy 7500 Real Time PCR Systems, đóng máy và ấn Start run.
• Sau khi máy chạy và ghi tín hiệu, kết quả được lưu dưới dạng file.eds và được đọc bằng phần mềm 7500 Software v2.3.

6.5. Phân tích kết quả

• Kiểm tra giá trị CT ở mỗi cặp mồi và từng nồng độ. Trong 3 lần lặp lại, giá trị này có ổn định không? Sự thay đổi trong vòng phạm vị 1 cycle thì có thể chấp nhận.
• Giá trị CT ở cùng cặp mồi, thì với nồng độ cao hơn, giá trị CT càng thấp. Đối chiếu xem giá trị này có tỉ lệ nghịch theo đúng các nồng độ pha loãng không.
• Chọn tất cả các mẫu và nồng độ, vào mục gene expression để đánh giá tương quan so sánh giữa mẫu bệnh nhân và mẫu chứng. Nếu tỉ lệ giữa mẫu bệnh nhân và mẫu chứng là 0.5, đánh giá có sự mất đoạn với số bản copy là 0.5×2= 1 bản copy của đoạn NST phân tích (NST thường hoặc cặp XX), nếu tỉ lệ là 1.5, đánh giá có sự lặp đoạn với số bản copy là 1.5×2=3 bản copy của đoạn NST phân tích (NST thường hoặc cặp XX).
• Tỉ lệ được chấp nhận là từ 0.8-1.2 quy đổi 2 copy (bình thường). Dưới 0.65 quy đổi 1 copy (mất đoạn), trên 1.35 quy đổi 3 copy (lặp đoạn), trong khoảng 0.65-0.8 hoặc 1.2-1.35 cân nhắc lặp lại thí nghiệm hoặc đánh giá khảm tùy trường hợp.

7. Kiểm soát chất lượng

• Nhận mẫu đúng quy trình, kiểm tra thông tin mẫu bệnh, đảm bảo đúng mẫu bệnh và chất lượng mẫu đạt chuẩn
• Đo nồng độ và chất lượng DNA sau khi tách bằng nanodrop
• Kiểm tra CT của các phản ứng lặp lại có gần bằng nhau hay không

8. Xử lý mẫu và chất thải

• Không áp dụng

9. Biểu mẫu/bảng kiểm/phụ lục

Phụ lục 1. Lưu đồ thực hiện

Định lượng DNA bằng kỹ thuật Realtime PCR

Phiếu theo dõi thực hiện xét nghiệm định lượng DNA bằng kỹ thuật Realtime PCR

Tài liệu tham khảo/Tài liệu liên quan

• Applied BiosystemsTM 7500 Real-Time PCR System (https://www.fishersci.ca/shop/products/7500-real-time-pcr-system-5/4351104)

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của Vinmecdr. Việc sao chép, sử dụng phải được Vinmecdr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. Vinmecdr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. Vinmecdr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết Vinmecdr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc Vinmecdr đựợc liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó. 

0