Hướng dẫn quy trình xét nghiệm vi khuẩn, vi nấm nuôi cấy hệ thống tự động bệnh phẩm dịch não tủy

Người thẩm định: Đoàn Mai Phương Người phê duyệt: Phùng Nam Lâm Ngày phát hành: 16/05/2022
Khi hệ thần kinh trung ương bị tổn thương, dịch não tủy sẽ có những thay đổi tương ứng. Việc xét nghiệm lúc này sẽ định hướng cũng như giúp các bác sĩ lâm sàng có những chẩn đoán xác định.

1. Mục đích của  xét nghiệm vi khuẩn, vi nấm nuôi cấy hệ thống tự động bệnh phẩm dịch não tủy

Mô tả quy trình thực hiện xét nghiệm nuôi cấy, phân lập vi khuẩn, vi nấm gây bệnh có trong bệnh phẩm dịch não tủy.
Quy trình này áp dụng cho nhân viên phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện đa khoa Quốc tế Vinmec, áp dụng cho tất cả các bệnh viện trong hệ thống Vinmec.

2. Trách nhiệm khi thực hiện

• Nhân viên được giao nhiệm vụ thực hiện xét nghiệm này tuân thủ đúng quy trình.
• Trưởng đơn nguyên, kỹ thuật viên trưởng đơn nguyên Vi sinh, trưởng tua trực chịu trách nhiệm giám sát việc tuân thủ đúng quy trình.

3. Nguyên lý

Sử dụng các môi trường  thạch  đĩa  giàu  chất  dinh dưỡng để nuôi cấy và phân lập vi khuẩn gây bệnh. Các vi khuẩn gây bệnh được định danh dựa vào các đặc điểm về hình thái học, một số tính chất sinh hóa hoặc dữ liệu protein, có thể kết hợp với tính chất kháng nguyên.

4. Loại mẫu sử dụng

• Bệnh phẩm dịch não tủy được chỉ định xét nghiệm nuôi cấy, định danh hệ thống tự động.
• Yêu cầu: 
  • Tuân thủ cách lấy bệnh phẩm theo “Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm”.
  • Các mẫu sau khi lấy xong nên được vận chuyển ngay đến Khoa Xét nghiệm để tiến hành xét nghiệm để cho kết quả chính xác. 
  • Nếu trì hoãn, bảo quản ở nhiệt độ 35 – 37 độ C, nhưng không quá 6h. Tuyệt đối không bảo quản trong tủ lạnh.

5. Trang thiết bị và vật tư

5.1. Thiết bị

• Máy Vitek 2-compact.
• Máy Malditof (Bruker).
• Kính hiển vi với vật kính dầu.
• Tủ ấm 35 độ C- 37 độ C.
• Tủ ấm CO2.
• Tủ ấm MEMMERT 25 độ C – 30 độ C.

5.2. Vật liệu

• Dụng cụ:
  • Que cấy.
  • Bút chì kính.
  • Đèn cồn.
  • Lam kính.
  • Dầu soi.
  • Pipette vô trùng.
  • Nước muối sinh lý (NaCl 0,9%).
• Hóa chất:
  • Thạch Melab Columbia + 5% sheep blood
  • Thạch Melab Chocolate + MultiVitox
  • Bộ thuốc nhuộm Gram: Bio Merieux, Pháp:
  • Các môi trường nuôi cấy, phân lập vi sinh vật, card định danh, kháng sinh đồ,.…

6. Chuẩn bị bệnh nhân

• Không áp dụng.

7. Quy trình thực hiện

7.1. Quan sát đại thể

• Số lượng khoảng 5 – 10ml.
• Ghi nhận các tính chất đại thể của DNT, như là:
  • Trong, keo.
  • Đục, mủ.
  • Vàng hay vàng chanh.
  • Có lẫn máu, có lẫn sợi fibrin, có lẫn cặn.

7.2. Nhuộm soi

• Dịch não tủy để lắng, không ly tâm. Dùng pipette vô trùng hút dịch ở đáy ống, nhỏ 1 – 2 giọt lên 2 lam kính, để khô tự nhiên. Thực hiện nhuộm Gram để đánh giá vi khuẩn và vi nấm) và nhuộm AFB (để tìm vi khuẩn lao và đánh giá tế bào).
• Thông báo kết quả soi trực tiếp cho bác sĩ lâm sàng.

7.3. Nuôi cấy

• Sử dụng một pipette vô trùng, hút dịch từ đáy ống bệnh phẩm.
• Nhỏ 2 hoặc 3 giọt dịch não tủy vào môi trường BA, CA và cấy phân vùng.
• Cấy thêm 1ml vào canh thang BHI tăng sinh vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí khó mọc nếu số lượng dịch não tủy nhiều hơn 1ml.
• Nếu bệnh phẩm dịch não tủy chỉ là 1 – 5 giọt, tiến hành như sau:
  • Sử dụng một pipette Pasteur vô trùng, nhỏ khoảng 0,5ml canh thang BHI vào ống bệnh phẩm. Đậy nắp ống, và lắc ống để trộn bệnh phẩm.
  • Sử dụng canh thang BHI đã trộn bệnh phẩm để cấy lên các môi trường và nhuộm Gram.
  • Ghi chú lại thể tích bệnh phẩm.

7.4. Ủ ấm

Thạch máu, chocolate: Ủ ở 35 – 37 độ C, khí trường 5% CO2, 24 – 48h, có thể đến 72h.

7.5. Đọc kết quả

• Kiểm tra đĩa nuôi cấy sau 24h – 48h.
• Khi không thấy khuẩn lạc mọc sau 24h, vẫn nên kiểm tra lại đĩa nuôi cấy sau 48h để có thể phát hiện thêm các vi khuẩn mọc chậm. 
• Bất cứ khi nào có sự hiện diện của vi khuẩn, phải nhuộm Gram và dựa trên tính chất khuẩn lạc mọc trên môi trường phân lập để xác định sơ bộ tính chất vi khuẩn và thông báo kết quả sơ bộ với bác sĩ điều trị.
• Nếu kết quả nhuộm Gram từ bệnh phẩm có vi sinh vật nhưng không thấy mọc khuẩn lạc hoặc chỉ định yêu cầu cấy nấm, ủ ấm tất cả các đĩa thạch ít nhất 1 tuần.
• Định danh bất kỳ vi sinh vật nào mọc trên môi trường nuôi cấy bằng xác định tính chất sinh vật hóa học trên máy Vitek hoặc dựa trên dữ liệu protein trên máy khối phổ Malditof. Tuy nhiên, khi có nhiều hơn 3 loại vi khuẩn mọc trên đĩa thạch, có thể bệnh phẩm đã bị nhiễm bẩn, cần đề nghị lấy lại bệnh phẩm và tiến hành nuôi cấy lần 2.

8. Kiểm tra chất lượng

8.1. Các việc cần kiểm tra trước và sau khi thực hiện quy trình

• Bệnh phẩm được lấy theo quy định.
• Các loại môi trường, card phải đảm bảo chất lượng và còn hạn sử dụng.
• Các trang thiết bị phải trong tình trạng hoạt động tốt.

8.2. Các yêu cầu hiệu chuẩn

Máy Vitek 2-comapct và máy Malditof được hiệu chuẩn hàng năm, theo quy định của nhà sản xuất.

9. An toàn

• Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo Chương trình an toàn phòng xét nghiệm.
• Thực hiện bảo hộ cá nhân đầy đủ khi tiếp xúc với các bệnh phẩm và tránh nhiễm chéo và không lây nhiễm cho nhân viên y tế;
• Trong trường hợp đánh đổ bệnh phẩm, phải cẩn thận làm sạch nơi bị đổ cùng với chất sát khuẩn để đảm bảo an toàn sinh học.

10. Dải tuyến tính

• Không áp dụng.

11. Diễn giải và báo cáo kết quả

11.1. Mô tả kết quả cần đạt được

• Dương tính: Phân lập được vi sinh vật gây bệnh bất kỳ. Ghi tên vi sinh vật gây bệnh phân lập được.
• Âm tính: nuôi cấy sau 48h không thấy vi khuẩn mọc.
• Tạp nhiễm: Trả kết quả “Không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh” khi nuôi cấy sau 48h không thấy khuẩn lạc gây bệnh mọc (trong trường hợp nghi ngờ bệnh phẩm bị nhiễm bẩn), và đề nghị lấy lại bệnh phẩm để nuôi cấy lần 2 (nếu cần).

11.2. Diễn giải kết quả về mặt lâm sàng

• Các vi sinh vật nuôi cấy dương tính được coi là tác nhân gây bệnh
• Không thấy bạch cầu đa nhân trung tính trong dịch não tủy không loại trừ nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm Listeria
• Nguyên nhân phổ biến nhất của viêm màng não do vi khuẩn mắc phải ở cộng đồng là S. pneumoniae
• Phân lập được N. meningitidis từ dịch não tủy phải báo cáo ngay để có biện pháp phòng ngừa vi khuẩn này gây dịch và sử dụng kháng sinh dự phòng
• Phân lập được Enterococci trong dịch não tủy thường có căn nguyên liên quan, ví dụ có thể nhiễm giun lươn.

11.3. Các căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não thường gặp

12. Các yếu tố ảnh hưởng

12.1. Các nguồn biến thiên tiềm tàng

• Bệnh phẩm lấy không đúng, không đủ số lượng.
• Bảo quản không đúng. Thời gian vận chuyển quá lâu.
• Dương tính giả có thể do bệnh phẩm bị nhiễm bẩn hoặc nhiễm vi khuẩn cư trú trên da
• Âm tính giả có thể do vi khuẩn có trong bệnh phẩm với số lượng ít, bệnh nhân đã điều trị kháng sinh từ trước hoặc vi sinh vật khó nuôi cấy.
• Quy trình này chỉ áp dụng tìm vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện và vi nấm, không áp dụng cho các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.

12.2. Các chú ý để đảm bảo tốt kết quả của quy trình

• Bệnh phẩm được lấy đúng kỹ thuật, đảm bảo vô trùng và đủ số lượng.
• Vận chuyển xuống khoa Xét nghiệm càng sớm càng tốt (trong vòng 15 phút).

13. Lưu hồ sơ

• Ghi chép rõ ràng kết quả vào hệ thống mạng Labconn và Sổ tiến trình soi cấy Vi sinh.

14. Tài liệu liên quan

• Hướng dẫn thu thập, xử lý, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm
• Quy trình xét nghiệm vi khuẩn, vi nấm bằng kỹ thuật nhuộm Gram
• Hướng dẫn kiểm tra chất lượng (QC) môi trường
• Hướng dẫn sử dụng máy định danh và kháng sinh đồ tự động
• Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học
• Hướng dẫn sử dụng tủ ấm thường
• Hướng dẫn sử dụng tủ ấm CO2

15. Tài liệu tham khảo

• ASM, Clinical Microbiology Procedures Handbook, 4th edition, 2016.
• WHO (2005) “Basic laboratory procedures in clinical bacteriology”. Second edition (TLBN.VS.TC.001)
• Nhà xuất bản y học (2012) “Xét nghiệm vi sinh lâm sàng” (TLBN.VS.TC.002)

Bản quyền và thương hiệu: Thông tin và hình ảnh trên website thuộc quyền sở hữu của VinmecDr. Việc sao chép, sử dụng phải được VinmecDr chấp thuận trước bằng văn bản. Miễn trừ trách nhiệm: Tất cả những tư liệu được cung cấp trên website này đều mang tính tham khảo. Do đó, nội dung và hình ảnh sẽ được thay đổi, cập nhật và cải tiến thường xuyên mà không phải thông báo trước. VinmecDr không bảo đảm về độ chính xác cũng như sự hoàn thiện về thông tin. Chúng tôi không chịu trách nhiệm pháp lý cho những thiệt hại xuất hiện trực tiếp hay gián tiếp từ việc sử dụng hoặc hành động dựa theo những thông tin trên hoặc một số thông tin xuất hiện trên website này. VinmecDr không chịu trách nhiệm pháp lý về những sai sót, lỗi chính tả… do nhập liệu cùng với những sự cố khách quan khác như: nhiễm virus, hành vi phá hoại, ác ý… xảy ra trên website này cũng như các website liên kết, nếu có. Đường link liên kết VinmecDr sẽ không chịu trách nhiệm hay có nghĩa vụ pháp lý dưới bất kỳ hình thức nào về nội dung của những website không thuộc VinmecDr được liên kết với website www.vinmecdr.com, bao gồm các sản phẩm, dịch vụ và những mặt hàng khác được giới thiệu thông qua những website đó.

0